La division cellulaire est un processus fondamental pour tous les organismes vivants. Avant chaque division, les informations génétiques stockées dans l’ADN de la cellule doivent être copiées de manière fidèle. La régulation de ce processus de copie, qui est appelé « réplication de l’ADN », joue un rôle essentiel dans la santé et la survie d’un individu. Comprendre comment les cellules régulent la réplication de l’ADN pour réaliser une duplication extrêmement fidèle du génome constitue l’une des questions fondamentales de la recherche biomédicale. Les erreurs générées au cours de la réplication de l’ADN peuvent mener à une instabilité du génome associée à des maladies graves comme le cancer. De fait, de précédents travaux de recherche ont estimé que jusqu’à deux tiers des cancers sont dus à une accumulation d’erreurs générées pendant la réplication de l’ADN.
Rencontrez une pionnière dans le domaine de la réplication de l’ADN
La Dre Hana Polasek-Sedlackova s’intéresse également à la manière dont les cellules répliquent leur ADN. C’est lors de sa participation à un stage de recherche à l’université Masaryk, lorsqu’elle n’était encore que lycéenne, que Hana a découvert pour la première fois le travail de laboratoire et la recherche sur l’ADN. Depuis lors, elle est devenue une étoile montante dans ce domaine. Pour son travail de thèse de licence, Hana a reçu le prix « Undergraduate Award in Life Sciences », un prix de renommée mondiale plus connu sous le nom de « Prix Nobel junior ». Une fois diplômée, Hana a reçu une bourse d’études de la Fondation Novo Nordisk afin d’intégrer leur programme de doctorat Copenhagen Bioscience PhD Program. Grâce à cette bourse d’études, Hana a intégré le laboratoire du professeur Jiri Lukas au Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, basé au sein de l’université de Copenhague, pour y préparer sa thèse de doctorat. Plus tard, elle a continué sa formation postdoctorale au sein de ce laboratoire. Son travail de recherche a été publié dans des revues scientifiques de premier rang, notamment Science et Nature. Récemment, elle a mis sur pied son propre groupe de recherche indépendant au sein de l’Institute of Biophysics (IBP) of the Czech Academy of Sciences, à Brno, en République tchèque.
L’une de ses contributions à la science est la résolution du paradoxe des protéines MCM, un sujet débattu au sein de la communauté des chercheurs spécialisés dans ce domaine depuis les années 1990. Les résultats obtenus par les méthodes de microscopie et les autres méthodes scientifiques généralement utilisées pour analyser les événements se déroulant lors de la réplication de l’ADN semblaient, jusqu’alors, contradictoires. Cette contradiction est aujourd’hui résolue grâce à notre station de criblage à haut contenu scanR, un équipement qu’Hana utilise beaucoup. Nous avons rencontré Hana à l’Institut de génétique moléculaire, à Prague, pendant une rencontre entre plusieurs utilisateurs de la station scanR. À cette occasion, nous lui avons poser quelques questions sur son expérience avec notre système et sur son impact sur ses travaux de recherche.
Notre entretien avec Hana Polasek-Sedlackova
Evident : Lorsque vous avez mis sur pied votre groupe de recherche à l’IBP, votre première acquisition fut la station de criblage à haut contenu scanR. Pourquoi avez-vous choisi ce microscope ?
Hana Polasek-Sedlackova : Au cours de mon expérience professionnelle, j’ai eu l’opportunité de travailler avec plusieurs microscopes. D’après mes observations, j’ai rapidement réalisé qu’il y avait trois paramètres importants à prendre en compte au moment de choisir un microscope. Ces paramètres sont l’appareil, le logiciel et le service à la clientèle. Après avoir analysé avec soin ces critères, j’en suis arrivée à la conclusion que le système scanR était le meilleur système de criblage à haut contenu.
Tout d’abord, l’appareil de la station scanR est un système simple pouvant s’adapter aux besoins spécifiques des expériences réalisées par l’utilisateur. Il offre des capacités d’imagerie allant du grand champ à la super-résolution, en passant par des techniques de microscopie de fluorescence avancées, l’imagerie de cellules vivantes, etc.
Ensuite, la station scanR est une plate-forme d’acquisition et d’analyse intuitive et facile à utiliser, qui permet aux utilisateurs d’acquérir en grand nombre des données de haute qualité en un temps record. L’analyse multiparamétrique en temps réel des données d’imagerie acquises permet une inspection immédiate des données pour mieux optimiser les paramètres d’acquisition, notamment avec l’utile fonction Rescan. (La fonction Rescan réalise une première numérisation rapide de l’échantillon à une faible résolution afin d’identifier les objets d’intérêt, qui peuvent ensuite être à nouveau numérisés à une résolution plus élevée.)
Enfin, Evident offre un service à la clientèle exceptionnel. Leurs spécialistes des applications pour l’entretien des microscopes et l’aide à l’analyse sont des professionnels aguerris qui sont toujours prêts à répondre aux besoins, souhaits ou problèmes des utilisateurs. C’est grâce à la Czech Science Foundation (Fondation tchèque des sciences) et à des financements internes de notre institut que nous avons pu acquérir la technologie scanR pour mon nouvel institut.
Mesure des dynamiques de la réplication de l’ADN à l’aide du système scanR
(A) Représentation schématique d’une cellule humaine avec un gros plan sur la fourche de réplication, une unité de base de la réplication de l’ADN. Des sondes fluorescentes spécifiques permettent d’analyser la liaison des protéines MCM à l’ADN (Halo), l’assemblage du complexe hélicase CMG actif (GFP) et la synthèse de l’ADN (EdU). (B) Analyse multiparamétrique des étapes
clés de la réplication de l’ADN dans des cellules U2OS d’ostéosarcome humain à l’aide du système scanR. (C) Galerie d’images illustrant les dynamiques des protéines impliquées dans le processus de réplication de l’ADN tout au long du cycle cellulaire.
Evident : Dans quelle mesure le système scanR vous a-t-il permis de faire avancer vos travaux de recherche ? Pouvez-vous nous donner un exemple dans lequel le système scanR vous a permis de faire de nouvelles découvertes ?
Hana : Le système scanR nous a permis de réaliser des découvertes fondamentales dans le domaine de la réplication de l’ADN. Dans le cadre de mes travaux de recherche, il a joué un rôle important dans la résolution du paradoxe des protéines MCM, un casse-tête relatif au comportement du complexe des protéines MCM2-7 jamais élucidé. Le complexe MCM forme le cœur de l’hélicase réplicative, une enzyme responsable de l’ouverture de la double hélice d’ADN nécessaire pour une réplication fidèle. Pendant des années, les chercheurs sont restés perplexes face à deux faits paradoxaux bien connus : (1) Pourquoi les cellules comprennent-elles des protéines MCM inactives en grand excès, si seulement 5 à 10 % d’entre elles sont utilisées comme hélicases réplicatives actives ? (2) Pourquoi n’a-t-il jamais été possible d’observer des protéines MCM eucaryotes au niveau des sites de réplication à l’aide des approches de microscopie ?
Nous nous sommes récemment penchés sur cette impasse conceptuelle et avons pu apporter des clarifications quant au paradoxe des protéines MCM. Grâce à l’outil d’édition génomique CRISPR-Cas9 et à l’imagerie à haut contenu scanR, nous avons réussi à résoudre certains défis de longue date que nous rencontrions avec l’imagerie des fourches de réplication de l’ADN dans les cellules vivantes et ainsi à révéler une nouvelle voie de l’homéostasie des origines de réplication de l’ADN nécessaire pour protéger l’intégrité du génome.1-2
Nous avons découvert que l’excès de protéines MCM inactives agit comme des sites naturels de pause de la réplication (NRPS) ajustant la vitesse de progression de la fourche de réplication afin de réduire au maximum les erreurs pendant la réplication de l’ADN. Par ce mécanisme, les NRPS représentent un autre niveau de contrôle de la vitesse de progression de la fourche de réplication exploité par les cellules cancéreuses, ce qui en fait de nouvelles cibles intéressantes pour le développement de nouveaux traitements anticancéreux. Actuellement, mon équipe de recherche étudie les voies de régulation les plus apicales des origines de réplication de l’ADN, ainsi que leur impact sur l’état physiopathologique du développement des tissus humains.
La découverte de variants de protéines des complexes MCM grâce au système scanR
a permis de faire la lumière sur le paradoxe des protéines MCM.
(A) Protocole de marquage HaloTag pour faire la distinction entre les pools de protéines MCM. L’analyse à haut contenu réalisée à l’aide du système scanR a permis de révéler des dynamiques différentes des complexes de protéines MCM parentales et naissantes pendant le processus de réplication de l’ADN. (B) Modèle décrivant la fonction distincte des protéines MCM parentales et
naissantes pendant la réplication de l’ADN. Alors que les protéines MCM parentales sont essentiellement converties en hélicases CMG actives, les protéines MCM naissantes restent pour la plupart inactives mais servent de sites naturels de pause du réplisome, qui jouent un rôle important dans l’établissement des conditions nécessaires à une progression correcte de la fourche de réplication.
Evident : Pour quelles applications utilisez-vous le système scanR, et quel type d’échantillons observez-vous ?
Hana : Dans le cadre de nos travaux de recherche, nous utilisons de nombreux modèles de culture tissulaire différents, la majorité d’entre eux étant dérivés d’échantillons humains. Cela inclut des lignées de cellules cancéreuses de divers tissus, comme des tissus osseux, mammaires, ovariens, cervicaux ou rénaux, et leurs lignées équivalentes non cancéreuses, des cellules souches et des fibroblastes. Parfois, dans le cadre de nos études, nous utilisons également des échantillons d’origine animale. Nous utilisons ces échantillons avec différentes approches génétiques, biochimiques et de biologie cellulaire afin d’identifier de nouvelles protéines ou voies de régulation complètes jouant un rôle fondamental dans la duplication génomique sans erreur. En outre, nous étudions les mécanismes de régulation de ces nouvelles protéines ou voies dans les cellules cancéreuses et si cela leur donne un avantage pour le développement des tumeurs. Si tel est le cas, nous pourrons utiliser nos connaissances pour mettre au point de nouvelles approches thérapeutiques contre le cancer.
Notre démarche expérimentale pour l’identification de nouveaux facteurs protéiques impliqués dans la réplication de l’ADN consiste à effectuer le profilage d’une grande population de cellules individuelles, et, pour ce faire, le système scanR s’est révélé très utile. Par exemple, lors de l’identification d’une potentielle nouvelle protéine, nous commençons par supprimer son expression dans les cellules en utilisant plusieurs méthodes. Ensuite, à l’aide de l’imagerie à haut contenu, nous surveillons la fidélité de la réplication de l’ADN à chaque étape. L’avantage d’utiliser des cellules dans nos expériences est que nous pouvons observer le processus de duplication du génome dans son environnement naturel. Toutefois, sa complexité peut également rendre l’interprétation des données difficile.
Par conséquent, pour l’étude de la réplication de l’ADN, nous devons analyser attentivement l’impact de la déplétion du gène étudié sur les autres processus cellulaires, comme le cycle cellulaire, la réponse aux dommages de l’ADN, la transcription, la maintenance de la chromatine, la maintenance de régions spécifiques des chromosomes, la stabilité générale du génome, etc. De tels profils quantitatifs et non biaisés de grandes populations de cellules individuelles obtenues dans un très court laps de temps nous aident énormément à interpréter rapidement nos données et, ainsi, faire avancer efficacement nos travaux de recherche.
Analyse de cellules individuelles dans l’image d’un cerveau de souris adulte à l’aide de la technologie d’apprentissage profond basée sur l’IA. L’échantillon de cerveau a été préparé par la Dre Jana Krejci (Department of Cell Biology Epigenetics à l’Institute of Biophysics).
« Auparavant, je passais des heures et des heures derrière mon microscope pour acquérir manuellement des images, puis derrière mon ordinateur pour les analyser. Ces expériences me prenaient des mois. Aujourd’hui, grâce au système scanR, tout peut être fait en seulement quelques heures. »
Evident : Comment ces applications tirent-elles profit des capacités d’analyse à haut contenu et de l’approche cytométrique basée sur les images du système ?
Hana : Dans le domaine de la biologie cellulaire, je pense que l’association d’informations quantitatives non biaisées à des images est une manière fiable et précise de représenter des processus cellulaires vitaux. Le système scanR constitue une solution élégante et intelligente. Comme je l’ai mentionné précédemment, le système scanR fournit une solution d’acquisition et d’analyse des échantillons entièrement automatisée, ce qui nous permet d’obtenir des informations quantitatives et non biaisées sur les processus cellulaires. Mais surtout, il est possible en un seul clic d’examiner directement les images dont sont tirées les données.
En outre, il est possible de créer des galeries d’images non biaisées qui illustrent les dynamiques des protéines étudiées tout au long de la vie de la cellule. Grâce à ce couplage image/données unique, il est possible focaliser l’analyse des processus cellulaires sur des compartiments particuliers, comme le noyau ou le cytoplasme, mais aussi sur des compartiments sous-nucléaires comme les foyers de réparation de l’ADN, etc. Cette complémentation visuelle des données quantitatives aide à résoudre plus facilement les problèmes biologiques.
Exemple de travaux en cours sur l’acquisition et l’analyse automatisées de fibres d’ADN
par utilisation conjointe des systèmes scanR et cellSens™
(A) Protocole de marquage CldU-IdU permettant la visualisation de fourches de réplication individuelles
(B) Exemples d’acquisition et de segmentation automatisées des fibres d’ADN par le système scanR et le logiciel cellSens™
Evident : Est-ce que ce système a changé votre approche de la microscopie en tant qu’outil de biologie cellulaire et de biologie moléculaire ? Utilisez-vous les capacités d’apprentissage profond TruAI™ du système ?
Hana : Lors de mes études de doctorat au sein du laboratoire du professeur Jiri Lukas, j’ai découvert l’imagerie à haut contenu et le système scanR. Cette technologie révolutionnaire a complètement changé ma vision de la biologie cellulaire et de la recherche, en général. J’ai été particulièrement impressionnée par sa capacité à fournir une analyse non biaisée et entièrement automatisée des processus cellulaires. Étant donné la crise actuelle en ce qui concerne la reproductibilité dans le monde de la recherche scientifique, je suis convaincue que les chercheurs doivent utiliser des outils qui leur permettent d’obtenir et d’analyser des données de manière entièrement automatisée, et ce, afin d’obtenir une représentation non biaisée des processus cellulaires.
L’avènement de l’intelligence artificielle (IA) permet de repousser les limites de l’analyse des images. Le système scanR est maintenant équipé du module d’apprentissage profond TruAI, ce qui lui permet d’étendre mon champ de recherche. Auparavant, je me concentrais principalement sur l’analyse de cellules individuelles au sein de grandes populations de lignées de cellules humaines cultivées. Maintenant, grâce au module d’IA, nous pouvons réaliser, par exemple, une analyse extrêmement précise des cellules individuelles dans des images de coupes d’organe.
L’association des systèmes scanR et cellSens™ est un autre exemple de la manière dont nous pouvons repousser les limites de nos capacités d’analyse des images. Cela nous permet de réaliser de manière entièrement automatisée des acquisitions et des analyses de molécules individuelles, telles que des fourches de réplication de l’ADN préparées selon la technique des fibres d’ADN. Il s’agit de quelques exemples de nouvelles applications sur lesquelles nous travaillons actuellement, et nous espérons que d’autres chercheurs profiteront bientôt de ces outils pour faire de grandes découvertes dans le domaine de la biologie cellulaire.
Evident : Qu’appréciez-vous le plus dans le système scanR ? Comment a-t-il été reçu parmi vos associés de recherche ?
Hana : J’aime beaucoup de nombreuses fonctionnalités offertes par le système scanR. Toutefois, si je ne devais n’en retenir qu’une, ce serait le lien unique entre l’acquisition et l’analyse automatisées, qui nous permet de réaliser une analyse multiparamétrique en temps réel des images acquises. J’ai été impressionnée par cette fonctionnalité alors que je n’étais encore qu’étudiante, comme tous ceux qui l’utilisent au sein de notre institut.
Voici comme l’un de mes collègues a parfaitement résumé les atouts du système scanR : « Auparavant, je passais des heures et des heures derrière mon microscope pour acquérir manuellement des images, puis derrière mon ordinateur pour les analyser. Ces expériences me prenaient des mois. Aujourd’hui, grâce au système scanR, tout peut être fait en seulement quelques heures. »
Pour plus de renseignements sur le système scanR
Nous tenons à adresser nos sincères remerciements à la Dre Hana Polasek-Sedlackova d’avoir partagé son expérience avec la station de criblage à haut contenu scanR. Pour en apprendre plus sur le système scanR et nos autres solutions de recherche en sciences de la vie, contactez directement Evident ou votre représentant commercial Evident local.
Photo de la Dre Hana Polasek-Sedlackova par Jana Mensatorova.
Références bibliographiques
- Polasek-Sedlackova H, Miller TCR, Krejci J, Rask MB, Lukas J. Solving the MCM paradox by visualizing the scaffold of CMG helicase at active replisomes. Nat Commun. 2022 Oct 14;13(1):6090. doi: 10.1038/s41467-022-33887-5. PMID : 36241664 ; PMCID : PMC9568601. https://www.nature.com/articles/s41467-022-33887-5
- Sedlackova, H., Rask, M.-B., Gupta, R., Choudhary, C., Somyajit, K., Lukas, J. (2020, October 21). Equilibrium between nascent and parental MCM proteins protects replicating genomes. Nature News. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2842-3