En vue de respecter les règles de distanciation sociale préconisées et de garantir la sécurité de leur personnel, les établissements de recherche restreignent dorénavant le temps passé en laboratoire, l’automatisation et la rationalisation des tâches relatives à l’imagerie sont donc plus importantes que jamais pour assurer le maintien de la productivité.
Ainsi, de nombreux éléments doivent être considérés en vue d’optimiser l’utilisation de votre équipement et d’éviter les situations inattendues qui pourraient requérir une reprise de certaines tâches et donc, un retour au laboratoire.
Voici quatre facteurs à prendre en compte :
1. Conservez la viabilité de vos échantillons en les maintenant dans un environnement chaud et stable.
L’un des plus grands défis de l’imagerie des cellules vivantes consiste à maintenir la viabilité des échantillons et à faire en sorte qu’ils se comportent normalement lorsqu’ils sont sortis de la chaleur et des conditions optimales de leur incubateur pour être placés sur la platine du microscope.
Cela peut sembler ardu, mais vous pouvez vous assurer que vos échantillons restent viables en utilisant les incubateurs sur platine ou les incubateurs fermés spécialement conçus pour les microscopes, lesquels maintiendront la stabilité de la température, du taux d’humidité et de la densité en CO2 nécessaires pour les cellules.
De plus, pensez à réchauffer l’objectif : il s’agit d’une source courante de contact froid qui peut nuire à la viabilité des échantillons.
N’oubliez pas non plus que la région périphérique des microplaques peut subir des fluctuations ambiantes supérieures à celles de la région centrale ; il est donc préférable d’utiliser les puits centraux plus stables et d’éviter les puits périphériques. Par exemple, si vous utilisez une plaque à 96 puits (12 × 8), alors n’utilisez que les 60 puits centraux (10 × 6) pour votre expérimentation.
Figure 1. Incubateur sur platine
2. Maintenez la stabilité de la température ambiante pour améliorer la mise au point
La température ambiante de la pièce où vous travaillez est un autre facteur à prendre en compte ; en effet, un changement de température, même minime, peut influencer les résultats d’imagerie.
La stabilité de la température ambiante est particulièrement critique pour l’observation à fort grossissement de cellules vivantes. Comme l’observation au moyen d’une grande ouverture numérique offre une faible profondeur de champ, votre système peut perdre la mise au point, même en cas de faible dérive en Z causée par une variation de la température.
Pour des conditions ambiantes optimales, assurez-vous du fonctionnement de votre climatiseur et de la stabilité de la température ambiante avant de commencer vos observations. De plus, pour encore plus de stabilité, évitez de placer le microscope directement dans le flux d’air conditionné.
3. Réglez avec précision la mise au point et la bague de correction pour améliorer la qualité de l’image.
Une autre façon de pallier les fluctuations temporelles comme la dérive en Z est de commencer l’expérimentation sur les cellules vivantes en réglant d’abord la mise au point et la bague de correction aussi précisément que possible.
Souvent, les chercheurs règlent soigneusement la mise au point, mais ils oublient de faire de même avec la bague de correction. Pourtant, un bon réglage de la bague de correction peut améliorer considérablement la qualité de l’image, en particulier lors de l’observation de tissus profonds ou lors de l’utilisation d’un objectif à grande ouverture numérique.
Le réglage idéal de la bague de correction dépend de nombreux facteurs, comme l’indice de réfraction de l’échantillon, la profondeur du plan d’observation et l’épaisseur de la lamelle couvre-objet. Même si la plupart des lamelles couvre-objet et des boîtes de culture en verre présentent une épaisseur de 170 µm (no 1.5), celle-ci peut fluctuer ; plus important encore, on ne peut tenir ces valeurs pour acquises dans le cas de boîtes en plastique.
C’est la raison pour laquelle il faut toujours régler précisément la bague de correction en vérifiant le contraste de l’image, notamment lors de l’utilisation de microplaques ou de boîtes en plastique.
Généralement, le réglage de la bague doit être effectué sur place. Pour les expériences qui nécessitent des réglages dynamiques de la bague de correction, comme l’observation en profondeur à l’aide d’un microscope multiphotonique, cela peut signifier plus de temps passé au laboratoire. Heureusement, vous pouvez automatiser ces réglages au moyen d’une bague de correction motorisée.
Figure 2. Bague de correction sur un objectif avec indicateur de l’épaisseur de la lamelle couvre-objet
Pour en savoir plus sur les systèmes à objectifs motorisés pour l’imagerie profonde, lisez notre article de blogue How to Improve Deep Imaging in Multiphoton Microscopy.
4. Utilisez un module dédié pour la mise au point sur les échantillons.
Mais, que faire si une dérive en Z se produit malgré tout ?
Même après toutes ces précautions, votre image peut encore ne pas être nette. Après tout, plusieurs facteurs peuvent provoquer une dérive en Z. Elle peut être causée par un changement dynamique et intentionnel, comme l’ajout de réactifs, par des vibrations physiques causées par une personne marchant dans la pièce ou par un changement de la température ambiante.
Bien que la plupart des microscopes motorisés sont dotés d’une fonction de mise au point automatique basée sur le contraste de l’image, ils présentent néanmoins certaines limites :
- Une capacité de réglage limitée
- La phototoxicité causée par la lumière d’excitation de la mise au point basée sur le contraste
Un moyen de maintenir la mise au point durant les expérimentations sur des cellules vivantes consiste à utiliser un module de mise au point dédié, comme notre dispositif de compensation de dérive en Z TruFocus basé à laser proche infrarouge. La lumière proche infrarouge peut également contribuer à minimiser la phototoxicité et la diaphonie sur la longueur d’onde d’imagerie lors d’une observation prolongée.
Alors que le mode de mise au point automatique en une seule fois du module évite tout éclairage inutile, le mode de mise au point en continu peut être utilisé pour l’observation en direct ou l’acquisition en continu d’images de phénomènes rapides.
Figure 3. Maintenez une mise au point nette sur les échantillons grâce au dispositif de compensation de dérive en Z TruFocus d’Olympus.
La brève vidéo ci-dessous montre le fonctionnement du dispositif de compensation de dérive en Z pour l’imagerie de longue durée :
Maintenez votre productivité en réalisant des expériences efficaces sur les cellules vivantes
Il y a toujours du travail à faire. C’est pourquoi nous espérons que ces conseils vous seront utiles pour maintenir votre productivité, réaliser une imagerie prolongée des cellules vivantes et poursuivre vos travaux scientifiques. Pour toutes questions sur la façon d’automatiser vos tâches de laboratoire, n’hésitez pas à communiquer avec nous.
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