La microscopie en lumière polarisée : ce qu’elle peut nous apprendre sur les matériaux qui composent notre tissu squelettique

Introduction

La microscopie en lumière polarisée est une technique optique avancée qui améliore le contraste des spécimens biréfringents. Elle procure des informations précises sur la structure et la composition d’un large éventail de matériaux organiques et inorganiques.

Deux types de microscopie en lumière polarisée sont couramment utilisés : la polarisation linéaire et la polarisation circulaire. Comme son nom l’indique, la polarisation linéaire utilise une lumière polarisée linéairement pour éclairer l’échantillon. La polarisation circulaire quant à elle utilise une lumière polarisée circulairement, ce qui la rend particulièrement sensible à la chiralité (orientation gauche ou droite) des structures au sein de l’échantillon. Ces techniques sont utilisées dans des domaines tels que la biologie, les sciences des matériaux et la géologie pour examiner la structure microscopique et les propriétés de divers matériaux.

Cette note d’application explore en détail ces techniques de lumière polarisée, avec un accent particulier sur la manière dont la polarisation circulaire permet une meilleure visualisation des matériaux biréfringents dans le tissu squelettique.

Les matériaux biréfringents du tissu squelettique

La biréfringence est la propriété d’un matériau qui fait en sorte qu’un rayon lumineux incident se divise en deux rayons distincts lorsqu’il traverse le matériau. La peau, la cornée, les tendons, les ligaments, le tissu musculaire, le cartilage et les os sont tous des tissus et des organes qui présentent une biréfringence en raison de leurs structures organisées et anisotropes (les propriétés optiques ne sont pas uniformes dans toutes les directions). Cette biréfringence affecte la façon dont les matériaux de notre squelette, tels que les os et le cartilage, interagissent avec la lumière polarisée.

Les os des mammifères et des oiseaux sont des matériaux rigides principalement constitués de collagène et de phosphate de calcium. Les os renferment les quatre types cellulaires suivants :

1. Les ostéoblastes, qui synthétisent le nouveau tissu osseux.
2. Les ostéocytes, qui sont intégrés dans la matrice osseuse.
3. Les ostéoclastes, qui réabsorbent l’os.
4. Les cellules ostéoprogénitrices, qui donnent naissance aux ostéoblastes.

Le cartilage constitue avec l’os ce qu’on appelle le tissu squelettique. Ce tissu conjonctif spécialisé est flexible, mais résistant. Il existe trois différents types de cartilage :

1. Le cartilage hyalin : le type de cartilage le plus courant dans tout le corps, notamment dans le nez, les côtes, la trachée, le larynx, les bronches et les surfaces articulaires des os. Il joue un rôle important lors du développement embryonnaire et de la croissance en formant le squelette fœtal et le cartilage épiphysaire, lequel sera ensuite remplacé par de l’os.
2. Le fibrocartilage : présent entre les vertèbres de la colonne vertébrale et dans certaines articulations.
3. Le cartilage élastique : présent dans l’épiglotte, les cordes vocales et l’oreille externe.

De nombreuses substances sont connues pour leur effet sur la santé des os et du cartilage. L’une d’entre elles est la vitamine C, également appelée « acide ascorbique ». Des études scientifiques ont montré que la vitamine C est essentielle à la santé des os, car elle est nécessaire à la formation de collagène et elle peut induire l’expression des gènes de la matrice osseuse dans les ostéoblastes. Dans le cartilage, la vitamine C a été associée au ralentissement de l’ostéoarthrite (une maladie qui provoque une dégénérescence articulaire), car elle stimule la synthèse du collagène.

Comprendre la microscopie en lumière polarisée linéairement et circulairement

Pour prendre des images de haute qualité d’os, de cartilage, de vitamine C et d’autres matériaux biréfringents à l’aide de la microscopie en lumière polarisée, il est important de comprendre d’abord les méthodes d’éclairage en lumière polarisée linéairement et circulairement.

Les sources de lumière génèrent une lumière non polarisée, qui vibre dans tous les angles à 360 degrés. Lorsque la lumière non polarisée traverse un polariseur, elle est convertie en lumière polarisée linéairement. La lumière polarisée linéairement passe à travers l’échantillon. Si l’échantillon est isotrope (propriétés optiques uniformes dans toutes les directions), cela n’affectera pas la lumière polarisée et la lumière restera dans le même état de polarisation. Cependant, si l’échantillon est anisotrope, il modifiera la polarisation de la lumière lors de son passage. Ce changement de polarisation permet à la lumière de traverser un analyseur, qui est orienté perpendiculairement au polariseur.

Un inconvénient de la polarisation linéaire est la formation d’isogyres, des bandes sombres en forme de croix de Malte (croix avec des bras en forme de V) qui apparaissent dans le champ de vision. Cela se produit lorsque l’échantillon observé possède une symétrie radiale, qui entraîne la division de la lumière polarisée autour du centre radial et la création de lumière qui ne peut pas passer à travers l’analyseur. La croix de Malte provoque une diminution de l’intensité, ce qui affecte l’utilisation des images pour la quantification ou l’analyse.

La polarisation circulaire n’a pas cet inconvénient. Elle utilise également un polariseur pour convertir la lumière ordinaire en lumière vibrant dans un seul plan (lumière polarisée linéairement). Cependant, avec la polarisation circulaire, un matériau biréfringent tel qu’une lame quart d’onde est placé à un angle de 45° par rapport au polariseur sur le trajet de la lumière polarisée. La lumière subira un déphasage, lequel représente l’écart de temps nécessaire aux ondes lumineuses pour passer à travers le matériau. Il en résulte une lumière avec un champ rotatif circulaire. Lorsque la lumière circulaire rotative passe à travers l’échantillon, elle est réfractée dans toutes les positions de rotation à 360 degrés. Le placement d’une deuxième lame quart d’onde à un angle de 90° par rapport à la première lame sur le trajet de la lumière réfractée fait en sorte d’annuler cet effet. Cela crée à nouveau une lumière polarisée linéairement, qui peut ensuite passer à travers l’axe de transmission de l’analyseur. Il est important de préciser que les deux lames quart d’onde sont tournées d’un angle de 45° par rapport au polariseur, mais dans des sens opposés.

Figure 1. Cristaux de vitamine C observés au moyen de la microscopie en lumière polarisée a) linéairement et b) circulairement à l’aide du scanner de lames pour la recherche SLIDEVIEW™ VS200 d’Evident et de l’objectif MPLFLN40X (ON de 0,75). (a) Avec une polarisation linéaire, on peut voir les isogyres caractéristiques (bandes noires). (b) Avec une polarisation circulaire sur le même échantillon, nous n’observons aucun artefact.
 

Imagerie des os, du cartilage et de la vitamine C à l’aide de la microscopie en lumière polarisée

La vitamine C, également appelée « acide ascorbique », est une molécule chirale. Lorsque la lumière polarisée passe à travers les cristaux de vitamine C, la chiralité de la molécule provoque la rotation du plan de polarisation de la lumière. L’interférence lumineuse produit toute une gamme de couleurs, ce qui se traduit pas des images magnifiques.

Figure 2. Images de vitamine C réalisées par microscopie en lumière polarisée. a) Avec la polarisation linéaire, on peut voir les isogyres caractéristiques (croix de Malte). b) La polarisation circulaire ne produit pas de croix de Malte. Les structures ressemblant à de la pierre brune présentées ici sont des cristaux très épais. Images prises à l’aide du scanner de lames pour la recherche VS200 avec l’objectif MPLAPON50X (ON de 0,95).

Figure 3. Images de tissu conjonctif et d’os, où les fibres de collagène d’orientation différente sont visualisées au moyen de lumière polarisée. a) Tissu conjonctif visualisé au moyen de lumière polarisée linéairement. b) Tissu conjonctif visualisé au moyen de lumière polarisée circulairement. c) Coupe osseuse transversale visualisée au moyen de lumière polarisée linéairement. d) Coupe osseuse transversale visualisée au moyen de lumière polarisée circulairement. Les fibres de collagène alignées transversalement apparaissent brillantes, tandis que celles alignées longitudinalement apparaissent foncées. Les fibres avec des orientations intermédiaires présentent différentes nuances de gris. Images prises à l’aide du scanner de lames pour la recherche VS200 avec l’objectif MPLAPON50X (ON de 0,95).

L’importance d’utiliser l’imagerie en lumière polarisée pour les études sur les tissus squelettiques et la vitamine C

Les images prises au moyen de la microscopie en lumière polarisée sont très belles, mais quelle est leur pertinence sur le plan scientifique ? Dans le cas de la vitamine C, l’interaction des molécules avec la lumière polarisée est une propriété utilisée en analyse chimique pour déterminer la concentration et la pureté de la vitamine C. Cela se fait généralement à l’aide d’un polarimètre.

Dans les os, des études utilisant la microscopie en lumière polarisée circulairement ont permis de cartographier les motifs d’orientation des fibres de collagène. Cela a été corrélé avec les données liées aux contraintes osseuses. On sait désormais que les fibres de collagène à orientation principalement transversale résistent mieux aux forces de compression, tandis que les fibres longitudinales résistent mieux aux forces de traction. De plus, les fibres de collagène orientées à 45° par rapport à la lamelle procurent une meilleure résistance au cisaillement.

Il a également été démontré que l’orientation des fibres de collagène dans le cartilage est importante pour la résistance à la pression et à la déformation dues à la charge ou au mouvement. Des perturbations dans l’organisation du collagène à l’intérieur du cartilage, même mineures, ont été associées à des maladies telles que l’ostéoarthrite.

* Les composants de polarisation circulaire pour le scanner VS200 sont actuellement disponibles uniquement dans la région EMEA. Contactez le représentant commercial Evident de votre région pour obtenir de plus amples renseignements sur leur disponibilité.
 

Bibliographie

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Auteurs

Laura Lleras Forero, directrice marketing produit, recherche en sciences de la vie, EMEA, Evident
Heiko Gäthje, formateur principal, école de formation, Evident