Analyse d’images en fluorescence : division cellulaire dans les sphéroïdes

La division cellulaire à l’intérieur des sphéroïdes peut être observée grâce au marquage des noyaux des cellules et des microtubules. Le nombre de cellules en mitose à l’intérieur des sphéroïdes peut être déterminé à partir d’images acquises par un microscope confocal à balayage laser à l’aide du module de numération du logiciel NoviSight™.

Objectifs

Le degré de malignité des tissus cancéreux est évalué en mesurant le nombre de cellules en mitose ou en mitose anormale. Le nombre de cellules cancéreuses en mitose est habituellement déterminé par la cytométrie en flux. Avec cette technique, les tissus cancéreux sont dissociés et les noyaux marqués afin de compter le nombre de cellules en mitose, que ce soit dans une culture cellulaire 2D ou 3D. Étant donné que la cytométrie en flux ne permet pas visualiser les structures 3D d’origine des tissus, il est impossible d’identifier la localisation des cellules en mitose à l’intérieur des tissus cancéreux. Il est également difficile d’analyser la relation entre les caractéristiques morphologiques, comme la taille de la tumeur, et la division cellulaire. Au cours de cette étude, nous avons pu observer avec succès les cellules en mitose à l’intérieur d’un sphéroïde tumoral intact en marquant les noyaux et les microtubules puis en clarifiant les tissus. Cette méthode nous a permis, lorsqu’elle est associée au logiciel NoviSight™, de compter le nombre de cellules en mitose. L’analyse quantitative des images a permis de localiser les cellules en mitose et les cellules en mitose anormale.

Préparation des échantillons

En vue de préparer les sphéroïdes, du milieu de culture a été ensemencé avec une suspension de cellules HT-29 dans une microplaque de 96 puits PrimeSurface® (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD) à raison d’une densité d’ensemencement de 500 cellules/puits. Après cinq jours de culture, les cellules avaient formé des sphéroïdes. Nous avons alors traité ces derniers avec plusieurs concentrations de Paclitaxel. Après l’ajout de Paclitaxel, les sphéroïdes ont été incubés pendant 48 heures et fixés au paraformaldéhyde à 4 %. Les noyaux et les microtubules des cellules ont respectivement été marqués au Hoechst 33342 (DOJINDO) et par un anticorps anti-tubuline conjugué à l’Alexa Fluor 488. Les sphéroïdes marqués ont été traités avec un réactif de clarification des tissus, ScaleS, pendant une nuit à 37 °C.

Conclusion
Acquisition et analyse d’images en fluorescence

Des images en fluorescence des sphéroïdes ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser FV3000. Dans les sphéroïdes du groupe témoin non traité, la formation des fuseaux mitotiques par les microtubules, une caractéristique spécifique des cellules en mitose, a pu être observée dans trois couches cellulaires depuis la surface du sphéroïde (A). Le logiciel NoviSight™ a été utilisé pour la numération des cellules en mitose des sphéroïdes du groupe témoin et des groupes traités au Paclitaxel (B, C). Les résultats montrent que plus la concentration en Paclitaxel est élevée, plus le nombre de cellules en mitose augmente (D). Les résultats indiquent clairement que le Paclitaxel agit comme un inhibiteur de la dépolymérisation des microtubules.

PrimeSurface est une marque déposée de Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
Olympus est une marque déposée, et NoviSight, Insightful Analysis et Intelligent Answers sont des marques de commerce d’Olympus Corporation.