Imagerie en fluorescence, contraste de phase et bioluminescence de cellules vivantes incubées dans des boîtes à fond en plastique à l’aide d’un objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique (ON)

Introduction
Imagerie de cellules souches incubées dans des boîtes à fond en plastique

Les boîtes de culture généralement proposées par de nombreux fabricants de chambres d’incubation pour l’observation en fluorescence des cellules vivantes sont des boîtes à fond de verre, mais certains types de cellules ne peuvent être cultivés correctement sur une surface en verre et nécessitent d’utiliser des boîtes à fond en plastique.
La différenciation en cellules cibles de certains types de cellules souches, telles que les cellules iPS (cellules souches pluripotentes induites) et les cellules ES (cellules souches embryonnaires), est plus facile à obtenir lorsque les cellules sont cultivées sur un substrat en plastique. En fait, certains types de cellules ne peuvent pas du tout se différencier en cellules cibles lorsqu’elles sont incubées dans des boîtes à fond de verre. Cependant, l’inconvénient d’utiliser des boîtes à fond en plastique est que l’autofluorescence du plastique complique souvent l’imagerie en fluorescence et produit un fort bruit de fond. Le rapport signal/bruit s’en trouve altéré et il devient plus difficile d’obtenir une image de l’échantillon fluorescent.
Les chercheurs spécialisés dans les cellules souches veulent être en mesure d’effectuer des observations en fluorescence exploitables à partir de boîtes à fond en plastique. Pour répondre à ce besoin, Olympus a conçu un objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique (UCPLFLN20XPH), dont l’ouverture numérique est nettement améliorée par rapport à un objectif 20x à contraste de phase classique. L’ouverture numérique améliorée produit un meilleur rapport signal/bruit et donc une imagerie en fluorescence de meilleure qualité avec des boîtes à fond en plastique. Ainsi, les chercheurs peuvent observer plus efficacement le processus de différenciation des cellules souches grâce à l’imagerie intermittente en fluorescence et évaluer plus facilement la confluence ou le taux de transfection des cellules cultivées dans des boîtes à fond en plastique.
Dans cette note d’application, nous montrons de quelle manière l’objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique d’Olympus permet une observation e en contraste de phase et en fluorescence avec un bon rapport signal/bruit de cellules souches dans une boîte à fond en plastique. Nous décrivons également un exemple d’imagerie de bioluminescence à l’aide du même objectif.

Application : Observation en fluorescence et contraste de phase à l’aide d’objectifs 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique d’Olympus

Des cellules souches embryonnaires (CSE) de souris exprimant une protéine de fusion entre l’histone et la GFP (GFP-H2B) dans les noyaux ont été incubées dans des boîtes à fond en plastique. Des images de ces cellules ont été acquises à l’aide d’un objectif 20x classique à contraste de phase (ouverture numérique = 0,4), puis elles ont été comparées à des images acquises au moyen de l’objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique (ouverture numérique = 0,7) d’Olympus. 

Cellules murines exprimant la GFP-H2B

La comparaison des images ci-dessus révèle que les images acquises au moyen de l’objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique (UCPLFLN20XPH) présentent une fluorescence plus intense et que les nucléoles y sont facilement observables. Cela s’explique par le fait que les objectifs disposent d’une ouverture numérique améliorée tout en conservant une grande distance de travail (distance de travail : 0,8 à 1,8 mm).
Ces images démontrent qu’il est possible d’acquérir des images en fluorescence comparables à celles obtenues dans des boîtes à fond de verre au moyen de l’objectif UCPLFLN20XPH. La bague de correction de l’objectif permet de corriger facilement l’aberration sphérique générée par les différences d’épaisseur du fond des boîtes en plastique.

Conditions d’imagerie :
Échantillon : CSE murines
Marqueur fluorescent : GFP-H2B
Chambre d’incubation : boîte à fond en plastique
Objectif : objectif à contraste de phase et grande ouverture numériqueUCPLFLN20XPH
Caméra CCD : caméra numérique de microscope DP80
Microscope : microscope de recherche inversé IX73

Application : Augmentation de la sensibilité à la fluorescence de la caméra numérique de microscope DP80 à capteur CCD en mode CCD monochrome

Comme décrit ci-dessus, l’objectif 20x à contraste de phase et ouverture numérique élevée d’Olympus (UCPLFLN20XPH) a permis une observation en contraste de phase et en fluorescence avec un bon rapport signal/bruit des cellules incubées dans une boîte à fond plastique. Cependant, dans les expériences où les boîtes doivent être sorties de l’incubateur à plusieurs reprises pour vérifier la fluorescence des échantillons, il faut tout de même veiller à minimiser la phototoxicité produite par la lumière d’excitation. Dans de tels cas, l’utilisation d’une caméra très sensible à capteur CCD permet de réduire l’intensité de la lumière d’excitation reçue par l’échantillon grâce au raccourcissement de la durée pendant laquelle l’échantillon est exposé à une lumière potentiellement cytotoxique.
La caméra numérique de microscope DP80 d’Olympus offre la double fonctionnalité de reproductibilité des couleurs et d’imagerie CCD monochrome à haute sensibilité. L’utilisation du mode CCD monochrome de la caméra DP80 en conjonction avec l’objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique (UCPLFLN20XPH) a permis de détecter efficacement l’expression de la GFP sous le contrôle du promoteur du gène nanog (Nanog-GFP) dans des cellules iPS de souris à une intensité lumineuse faible, comme l’illustrent les images ci-dessous.

Expression du rapporteur Nanog-GFP dans des cellules iPS de souris

Conditions d’imagerie :
Échantillon : cellules iPS de souris
Marqueur fluorescent : Nanog-GFP
Chambre d’incubation : boîte à fond en plastique
Objectif : objectif à contraste de phase et grande ouverture numériqueUCPLFLN20XPH
Caméra CCD : caméra numérique de microscope DP80
Microscope : microscope de recherche inversé IX73

Application : Imagerie de bioluminescence hautes performances

L’objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique d’Olympus (UCPLFLN20XPH) permet d’obtenir des performances exceptionnelles dans le cadre d’applications délicates telles que l’imagerie de bioluminescence avec des boîtes à fond en plastique. L’imagerie de bioluminescence permet de détecter quantitativement l’expression d’un gène au niveau d’une cellule unique. Cette méthode d’imagerie est facilement réalisable avec le modèle Olympus LV200, un microscope spécialement conçu pour l’imagerie de bioluminescence. Lorsque l’objectif UCPLFLN20XPH est utilisé en combinaison avec le microscope LV200, plusieurs cellules peuvent être observées dans un même champ. Comme illustré dans l’image ci-dessous, les CES murines isolées exprimant le rapporteur bioluminescent Nanog-Luc (jaune) peuvent facilement être visualisées en contraste de phase avec une sensibilité élevée.

Conditions d’imagerie :
Échantillon : CSE murines
Bioluminescence : Nanog-Luc
Chambre d’incubation : boîte à fond en plastique
Objectif : objectif à contraste de phase et grande ouverture numériqueUCPLFLN20XPH
Microscope : système d’imagerie de bioluminescence LV200

Conclusion

Les exemples présentés illustrent comment l’objectif 20x à contraste de phase et grande ouverture numérique d’Olympus (UCPLFLN20XPH) permet de réaliser des images de fluorescence et de bioluminescence en contraste de phase de cellules cultivées dans des boîtes à fond en plastique avec un excellent rapport signal/bruit. L’objectif UCPLFLN20XPH est compatible avec le compensateur de dérive en Z IX3-ZDC2 et la gamme IX3 de microscopes de recherche motorisés inversés. Lorsqu’il est équipé d’une platine motorisée, un système d’analyse cellulaire entièrement motorisé pour boîtes à fond en plastique peut être facilement configuré.