Quel âge a le poisson ? Utilisation d’un scanner de lames pour la recherche SLIDEVIEW™ VS200 pour surmonter les difficultés de l’observation des otolithes de poissons

Introduction

Les poissons du genre Clupea, également connus sous le nom de harengs, ont joué un rôle essentiel dans l’histoire des pêcheries marines de l’Atlantique Nord et, au début du XX^e siècle, leur étude s’est révélée fondamentale dans l’évolution de la science halieutique (figure 1). Ces poissons gras constituent également un aliment important pour l’homme depuis très longtemps.

Le hareng se déplace souvent en groupes de grande taille dans les bancs de pêche et à proximité des côtes, en particulier dans les eaux tempérées peu profondes des océans Pacifique Nord et Atlantique Nord, mer Baltique comprise, ainsi qu’au large de la côte ouest de l’Amérique du Sud. Trois espèces de Clupea sont connues, et elles représentent environ 90 % de tous les harengs prélevés par les pêcheries.

_{Figure 1. Hareng}

Les études sur l’âge et le développement des poissons sont essentielles pour comprendre la période et le volume du frai, le recrutement biologique, le profil d’utilisation de l’habitat, la durée des stades larvaire et juvénile et la répartition des âges d’une population donnée. Ces connaissances sont, à leur tour, importantes pour la conception de politiques de gestion de la pêche pertinentes. Il est possible de déterminer l’âge d’un poisson en comptant les stries des otolithes.

_{Figure 2. Otolithe de hareng}

Les otolithes d’un poisson accrètent des couches de carbonate de calcium et de matrice gélatineuse tout au long de la vie de l’individu. Le taux d’accrétion varie avec le développement du poisson, en général avec une croissance moindre en hiver et plus importante en été, ce qui entraîne l’apparition de stries évoquant les cernes de croissance des arbres. En comptant ces stries, il est possible de déterminer l’âge du poisson en années. De plus, chez la plupart des espèces, l’accrétion du carbonate de calcium et de la matrice gélatineuse alterne selon un cycle quotidien, ce qui permet de déterminer l’âge d’un poisson en jours. Ces informations ne peuvent être obtenues qu’au microscope et elles fournissent des données importantes pour les études sur les stades précoces de la vie.

Expérience

Des chercheurs ont extrait des otolithes, les ont inclus dans de la résine acrylique et les ont meulées jusqu’à une épaisseur d’environ 50 μm.

Traditionnellement, on utilisait un microscope droit manuel capable de fonctionner en lumière polarisée pour observer l’otolithe et compter les stries quotidiennes.

La visibilité des couches individuelles (stries) varie avec le plan focal, ce qui rend cette méthode très fastidieuse, car l’observateur doit constamment remettre au point l’otolithe.

Le scanner de lames SLIDEVIEW VS200 d’Olympus peut être utilisé pour automatiser la prise d’images d’otolithes, ce qui permet de gagner un temps considérable (figure 3). Le système peut être configuré pour acquérir un emplilement de plans Z sur un maximum de 31 plans à différents grossissements, avec une lumière polarisée ou en fond clair. En fond clair en lumière transmise, le diaphragme d’ouverture motorisé peut être réglé pour améliorer le contraste en fermant l’ouverture en fonction de l’ouverture numérique de l’objectif (figure 4A).

_{Figure 3. Scanner de lames pour la recherche SLIDEVIEW VS200 d’Olympus}

Résultats

L’otolithe juvénile a un diamètre d’environ 75 μm. L’otolithe adulte a un diamètre d’environ 1180 μm. L’image 4b a été prise avec un microscope en lumière polarisée conçu pour observer des spécimens visibles principalement en raison de leur caractère anisotrope. Le scanner doit être équipé d’un polariseur placé dans le trajet lumineux précédant l’échantillon et d’un analyseur (second polariseur) dans le trajet optique entre l’ouverture arrière de l’objectif et le port de la caméra. Le contraste de l’image provient de l’interaction entre la lumière polarisée selon le plan et un échantillon biréfringent (à double réfraction), qui produit deux composantes d’onde individuelles polarisées dans des plans perpendiculaires entre eux.

Si l’on observe attentivement le centre d’un otolithe, on s’aperçoit que les stries y sont beaucoup plus denses qu’à la périphérie. Ce phénomène est clairement visible dans les figures 5A et 5B. Les images illustrent également l’importance d’acquérir des images en plusieurs plans focaux (empilement de plans Z), vu que la visibilité des stries varie à différents niveaux.

Le système VS200 automatise l’acquisition d’images d’otolithes, ce qui dispense les utilisateurs des tâches fastidieuses de mise au point et d’acquisition manuelles. Comme les images sont numérisées, il est possible de créer un programme d’analyse d’images numériques entièrement automatisé pour compter les couches des otolithes et ainsi déterminer l’âge du poisson.

Figure 5A. Découpe du centre de l’empilement des plans Z d’un otolithe juvénile. Les différents plans focaux (Z) sont affichés dans l’ordre de leur position sur l’axe Z en μm (en commençant en haut à gauche et en terminant en bas à droite). La distance entre chaque plan focal est de 1,17 μm. L’empilement des plans Z s’étend sur une distance de 20 μm, et la distance entre les couches de l’otolithe dans la partie centrale est seulement de 600 nm environ.

Figure 5B. Découpe du centre de l’empilement des plans Z d’un otolithe adulte. Les différents plans Z sont affichés dans l’ordre de leur position sur l’axe Z en μm. La distance entre chaque plan Z est de 1,17 μm. L’empilement des plans Z s’étend sur une distance de 34 μm, et la distance entre les couches de l’otolithe dans la partie centrale est de 740 nm environ.

Conclusion

Le scanner de lames utilisé pour la recherche SLIDEVIEW VS200 constitue un moyen simple et pratique d’acquérir des images d’otolithes de poissons inclus dans de la résine. Chez les poissons juvéniles, la distance entre les couches de l’otolithe n’est que de 600 nm environ, ce qui nécessite un système d’imagerie capable d’un fort grossissement et d’une grande résolution. En utilisant un objectif UPlanXApo 40X avec une ouverture numérique de 0,95, le système VS200 procure le grossissement et la résolution nécessaires pour acquérir ces images.

Les échantillons d’otolithes adultes sont également assez épais (jusqu’à 34 μm) et peu transparents puisqu’ils sont en carbonate de calcium. Le système VS200 dispose de fonctionnalités avancées qui permettent de surmonter ces difficultés pour acquérir des images de haute qualité. Le système peut numériser les échantillons épais sur plusieurs plans focaux en lumière polarisée. Pour améliorer le contraste dans les échantillons d’otolithes, le diaphragme d’ouverture du système peut être fermé pour rendre les stries plus visibles et en faciliter ainsi le comptage.

Remerciements

Cette note d’application a été rédigée avec l’aide de Bastian Huwer du National Institute of Aquatic Resources, Section for Marine Living Resources, à Lyngby au Danemark.