Prise d’images intermittente de longue durée de la motilité et de la prolifération des cellules à l’aide du microscope confocal FLUOVIEW FV3000 d’Olympus et du système de compensation de la dérive en Z TruFocus

Les tests reposant sur l’imagerie de cellules en culture sont l’un des piliers fondamentaux de l’étude de divers phénomènes biologiques. Grâce à cette technique, les chercheurs peuvent observer la prolifération et la dynamique des cellules au fil du temps. Les populations cellulaires pouvant présenter des profils d’expression protéique et des schémas de motilité localement différents, les tests d’imagerie doivent être conçus avec soin afin d’éviter tout risque de biais et de résultats faussés dus à un échantillonnage insuffisant. Par conséquent, les expériences d’imagerie de cellules en culture doivent être conçues de manière à pouvoir observer plusieurs champs de la plaque ou du récipient de culture. Cette note d’application explique de quelle façon le microscope FV3000 facilite la prise d’images intermittente multizone avec des paramètres d’acquisition complexes pour obtenir des ensembles de données complets et fiables à partir d’une seule expérience.

Acquisition de plusieurs champs d’observation en une seule expérience

Dans cette expérience, le module MATL (prise d’images intermittente multizone) du microscope confocal FV3000 a été utilisé pour surveiller en continu la motilité et la prolifération de populations de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) exprimant une protéine fluorescente verte (GFP) cytosolique pendant une durée de 12,5 heures environ. Lors de la conception de l’expérience, il était important de surveiller plusieurs régions avec divers grossissements et paramètres d’empilement Z afin de suivre la dynamique de chaque cellule ainsi que la dynamique de la population dans son ensemble. Le module MATL permettant d’enregistrer des paramètres XYZT indépendants pour chaque position ou zone de la grille, diverses conditions d’imagerie ont pu être facilement programmées pour plusieurs régions avec des grossissements et des paramètres d’empilement Z variables dans le temps.

_{Figure 1. Schéma de l’expérience de prise d’images intermittente multizone. Pour chaque puits de la plaque de culture, plusieurs positions de zones individuelles et zones de la grille ont été programmées avec divers paramètres indépendants de grossissement et d’empilement en Z. Ces positions enregistrées ont été photographiées de façon cyclique sur une période de 12 heures et 25 minutes.}

Utilisation de la mise au point automatique d’après l’emplacement pour suivre la motilité et la prolifération des cellules HUVEC

L’une des plus grandes difficultés de l’imagerie multizone au cours du temps est la tendance de la mise au point à progressivement se décaler en raison de légères fluctuations de la température ambiante de la pièce dans laquelle le microscope se trouve. De plus, la distance entre la surface de la plaque de culture et l’échantillon de tissu peut varier si la surface de tissu n’est pas plane, ce qui rend encore plus difficile l’obtention d’images de haute qualité sur plusieurs champs d’observation. Le système de compensation de la dérive en Z TruFocus résout ces problèmes en utilisant un laser proche infrarouge non phototoxique pour localiser l’interface lamelle-échantillon et déterminer la position focale correspondante. La combinaison du système TruFocus avec la fonctionnalité MATL permet d’enregistrer plusieurs positions XYZT indépendantes avec une mise au point automatique spécifique de la position.

Dans cette expérience, plusieurs régions ont été photographiées au fil du temps avec différents grossissements et paramètres d’empilement en Z pour suivre les changements de motilité et de prolifération de cellules HUVEC, aussi bien au niveau des cellules individuelles qu’au niveau de la population. Comme le montre la vidéo de la figure 2, la combinaison de la fonctionnalité MATL et du système TruFocus a permis de prendre des images de façon intermittente de plusieurs puits tout en maintenant une mise au point précise pendant toute la durée de l’expérience de 12 heures.

_{Figure 2. Prise d’images intermittente multizone XYZT de cellules HUVEC exprimant une GFP cytosolique. Quatre images de positions différentes d’un échantillon prises avec des paramètres d’acquisition variables sont présentées. Le système TruFocus a été utilisé pour maintenir la mise au point sur l’échantillon dans les différents champs d’observation tout au long de l’expérience de 13 heures.}

Conditions d’imagerie

Deux panneaux supérieurs :
Objectif UPLXAPO20X
Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000RS
Laser : 488 nm (GFP, vert)
Scanner : résonnant
Série Z : 16 pas
Nombre total de zones analysées : 14

Deux panneaux inférieurs :
Objectif UPLXAPO10X
Microscope confocal à balayage laser FLUOVIEW FV3000RS
Laser : 488 nm (GFP, vert)
Scanner : résonnant
Série Z : 15 pas
Nombre total de zones analysées : 48

Durée totale de l’expérience : 13 heures et 11 minutes

Apport du microscope confocal FV3000 à notre expérience

Maintien de la mise au point pendant la prise d’images intermittente multizone à l’aide du système de compensation de la dérive en Z TruFocus d’Olympus

Le système de compensation de la dérive en Z TruFocus d’Olympus est un module entièrement motorisé qui corrige la dérive focale afin de maintenir la précision de la mise au point sur l’échantillon lors d’expériences de prise d’images intermittente de longue durée. Le système TruFocus multiplie les possibilités d’application en prenant en charge un grand nombre d’objectifs et de types de récipients, y compris les boîtes de culture à fond en verre et en plastique. Il est ainsi possible de générer des images prises en intermittence sur une longue durée claires et parfaitement nettes dans de multiples conditions d’imagerie, sans se soucier de la dérive en Z.

Le module logiciel de prise d’images intermittente multizone (MATL) permet l’utilisation de paramètres XYZT indépendants Le module logiciel de prise d’images intermittente multizone (MATL) contrôle la platine XY motorisée du microscope FV3000, ce qui permet l’utilisation de paramètres XYZT indépendants pour chaque position enregistrée ou zone de grille. Le module MATL produit des données d’images prises en intermittence fiables et exactes grâce à l’intégration complète au microscope inversé FV3000 et à la synchronisation précise assurée par ce dernier. Le système s’adapte ainsi parfaitement à l’imagerie de nombreux récipients de culture à fond en verre offerts dans le commerce ainsi que de supports et de microplaques conçus sur mesure.

Commentaire du Dr James Hoying Nous travaillons avec une variété de modèles de tissus vascularisés 3D cultivés dans de nombreux puits de plaques multipuits. Le système TruFocus et les fonctionnalités MATL du microscope FV3000 se sont révélés inestimables, car nous avons souvent besoin de mesurer la vascularisation et la morphologie des vaisseaux dans des douzaines de tissus à la fois à partir d’images confocales haute résolution des vaisseaux 3D.

Remerciements

Cette note d’application a été rédigée avec l’aide du chercheur suivant :

D^r James Hoying, scientifique en chef, Advanced Solutions Life Sciences