Distinguer les vaisseaux cérébraux des vaisseaux tumoraux dans les tissus profonds l’aide de la microscopie multiphotonique

La microscopie par excitation à deux photons (2PE) utilise généralement la lumière laser en très proche infrarouge (700 - 950 nm) comme lumière d’excitation, ce qui limite la profondeur d’imagerie à 500 µm. L’atténuation de la lumière dans les tissus biologiques est plus réduite avec le proche infrarouge (1000 - 1700 nm) qu’avec le très proche infrarouge. En imagerie tissulaire in vivo, la lumière proche infrarouge pénètre également plus en profondeur dans les tissus pour exciter les fluorophores. En outre, l’autofluorescence induite par la lumière proche infrarouge est bien plus faible qu’avec la lumière très proche infrarouge, ce qui permet d’améliorer le rapport signal sur bruit de fond des images 2PE.

Le microscope par excitation multiphotonique FVMPE-RS d’Olympus est équipé d’un système laser infrarouge pulsé InSight DS qui permet d’avoir recours à l’imagerie multiphotonique à une excitation comprise entre 680 et 1300 nm. Voici deux applications d’imagerie profonde in vivo qui tirent profit de l’utilisation d’un microscope à excitation multiphotonique en lumière proche infrarouge.

1. Mise au point de nanoparticules d’un polymère conjugué à une chaîne excitable dans le proche infrarouge pour l’imagerie cérébrale à deux photons profonde in vivo à travers un crâne intact^[1]

L’utilisation de la microscopie par excitation à deux photons sur un crâne de souris intact représente une véritable gageure du fait de la forte diffusion de la lumière induite par l’os. Pour surmonter ce défi, nous avons développé des nanoparticules (CPdots) d’un polymère conjugué à une chaîne excitable par une lumière dans le proche infrarouge et émettant une fluorescence intense dans le très proche infrarouge (pic à ≈ 725 nm et rendement quantique de 20,6 ± 1,0 %) pour l’imagerie 2PE profonde in vivo d’un crâne de souris intact. Grâce à l’utilisation du microscope FVMPE-RS d’Olympus équipé d’un système laser réglable ultrarapide, nous avons pu utiliser l’imagerie 2PE pour acquérir des images d’un cerveau de souris avec des excitations à 800, 1040 et 1200 nm. Ce système nous a permis d’ajuster librement la longueur d’onde de la lumière laser sans que cela soit compliqué. L’excitation à 1200 nm offre la plus grande profondeur d’imagerie et le plus grand rapport signal sur bruit de fond. En outre, nous avons obtenu une reconstruction 3D de la vascularisation cérébrale avec une grande profondeur verticale de 400 µm à travers le crâne intact.

Figure 1. Images 2PE de la vascularisation cérébrale d’une souris ayant reçu une injection de CPdots acquises dans la même colonne corticale (à une profondeur de 300 µm) sous une excitation laser FS à 800, 1040 et 1200 nm. L’émission a été collectée entre 660 et 750 nm. Chaque image a été acquise en 3,22 s. Échelle graphique pour toutes les images : 100 µm. Représentation graphique des profils d’intensité linéaire de l’excitation 2PE à travers les vaisseaux sanguins de chaque image (à droite). Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figure 2. Images 2PE reconstruites en 3D de la vascularisation cérébrale acquises à travers un crâne intact. Excitation pour la génération de seconde harmonique (SHG, couleur bleue) : 950 nm ; excitation pour la microscopie 2PE : 1200 nm. Les émissions ont été collectées entre 455  et 500 nm pour la SHG et entre 660 et 750 nm pour les vaisseaux sanguins. Chaque image a été acquise en 3,22 s. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Vidéo 1. Image 2PE reconstruite en 3D des vaisseaux sanguins cérébraux marqués aux CPdots. Excitation : 1200 nm. Émission : 660 - 750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.

2. La microscopie biphotonique intravitale avec excitation en proche infrarouge permet de différencier la vascularisation profonde du cerveau de celle d’une tumeur^[2]

L’imagerie intravitale de fluorescence de la vascularisation et des dynamiques cérébrales et tumorales avec une grande profondeur de pénétration et un grand rapport signal sur bruit de fond (RSB) est idéale pour l’étude et le diagnostic des maladies vasculaires et des cancers. Un fluorophore ultrabrillant avec une émission dans le proche infrarouge induite par agrégation a été mis au point pour l’observation du cerveau et des tumeurs au moyen de la microscopie intravitale par excitation à deux photons (2PE) dans le proche infrarouge. Grâce à l’importante capacité de pénétration de la lumière en proche infrarouge et de la forte luminosité du fluorophore, nous pouvons acquérir des images de la vascularisation dans les tissus profonds (cerveau et tumeurs).

Schéma 1. Représentation schématique d’une imagerie de fluorescence à deux photons in vivo d’une tumeur sous excitation en très proche infrarouge et en proche infrarouge. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Illustration 3. Image 2PE de vaisseaux sanguins d’une tumeur et de vaisseaux sanguins normaux marqués avec notre fluorophore. La réponse à l’excitation 2PE du vaisseau sanguin tumoral est meilleure que celle du vaisseau sanguin normal. Excitation : 1200 µm ; Émissions : 660 - 750 nm. Copyright 2019, Wiley-VCH.
 

Figure 4. Images 2PE reconstruites en 3D de la vascularisation d’une même tumeur acquises avec excitation en proche infrarouge (a) et en très proche infrarouge (b). Excitations : 1200 nm pour le proche infrarouge et 920 nm pour le très proche infrarouge. Échelles graphiques : 100 µm. Profondeur d’imagerie (à travers la peau) : 500 µm pour l’excitation en proche infrarouge et 300 µm pour excitation en très proche infrarouge. Copyright 2019, Wiley-VCH.

Références :

[1] NIR‐II Excitable Conjugated Polymer Dots with Bright NIR‐I Emission for Deep In Vivo Two‐Photon Brain Imaging Through Intact Skull
[2] NIR-II-Excited Intravital Two-Photon Microscopy Distinguishes Deep Cerebral and Tumor Vasculatures with Ultrabright NIR-I AIE Luminogen

Équipements d’imagerie

Microscope : système FVMPE-RS
Objectif : objectif à immersion dans l’eau 25x (XLPLN25XWMP2)

Commentaire du docteur Shaowei Wang

Le microscope multiphotonique FVMPE-RS d’Olympus est un outil puissant pour l’imagerie intravitale. Le laser infrarouge pulsé InSight DS à longueur d’onde variable entre 680 et 1300 nm est idéal pour de nombreuses applications d’imagerie de fluorescence à deux photons in vivo. Grâce au revêtement optique optimisé et à l’excellent objectif à transmittance élevée en proche infrarouge, il est possible d’utiliser la microscopie biphotonique intravitale avec excitation en proche infrarouge avec nos fluorophores ultralumineux. La profondeur d’imagerie et le rapport signal sur bruit de fond sont améliorés grâce à l’excitation en proche infrarouge.

Remerciements

Cette note d’application a été rédigée avec l’aide du Dr Shaowei Wang, chercheur au Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore (Page d’accueil)

Comment le microscope FVMPE-RS a facilité notre expérience