Validación de las observaciones multipunto con un sistema de monitorización de incubación

Introducción

Durante el proceso diario de cultivo celular, los operadores requieren dedicar mucho tiempo y esfuerzos a mantener y controlar las condiciones de cultivo. Para administrar adecuadamente las células mediante un flujo de trabajo convencional de cultivo celular, los operadores deben retirar las células del incubador para verificar su condición bajo un microscopio a través del tiempo, con observaciones y cálculos a partir del recuento celular y la confluencia.

Asimismo, la calidad de las células debe ser mantenida a un nivel constante durante la etapa de preparación con el fin de mejorar la regularidad y reproducibilidad de los experimentos. Sin embargo, pueden existir diferencias a nivel de la calidad operacional en función del nivel técnico de los operadores y de otros factores. Cabe resaltar que el cultivo celular es el punto de origen de la investigación en los ámbitos de las ciencias de la vida y sanitario; por tanto, la calidad celular repercute significativamente en los experimentos subsecuentes. En consecuencia, la calidad celular debe mantenerse y manejarse apropiadamente en función de ciertas condiciones de cultivo.

Nuestro sistema de monitorización de incubación CM30 simplifica este proceso al monitorizar de forma automática y a distancia las condiciones de cultivo celular desde el interior del incubador, las 24 horas del día, los 365 días del año. También, permite visualizar las condiciones celulares regularmente en función de los resultados analíticos obtenidos por la inteligencia artificial (IA). El sistema CM30, gracias a sus mediciones continuas y normalizadas, permite que los operadores cuantifiquen el estado celular de forma eficaz y reproducible sin basarse tan solo en su intuición.
 

Estimar el estado celular de recipientes completos a partir de observaciones multipunto

Para mantener la calidad celular, es importante que los operadores observen y manejen apropiadamente las condiciones celulares a diario. En el pasado, los operadores gastaban una valiosa cantidad de tiempo y esfuerzos para observar el recipiente completo por medio de un microscopio, a fin de comprender la condición celular y el momento más apropiado para el pasaje (pase) y recogida celular. En la actualidad, el operador más capacitado —por así decirlo— necesita verificar tanto el campo de observación dentro del recipiente así como el cultivo celular por completo, ya que el estado de este último puede ser irregular según el tipo de célula que se trate, así como el método de operación usado.

Por tal razón, el sistema CM30 puede digitalizar automáticamente la imagen del completo recipiente una vez al día, y capturar otras imágenes repetidamente en cualquier punto de observación específico. Esto permite a la cámara adquirir continuamente imágenes de la posición de observación deseada mientras se adquiere información periódicamente a partir del recipiente de cultivo celular.

Sin embargo, recoger información a partir de todo el recipiente en cada etapa del proceso de cultivo conlleva a varios riesgos asociados al hardware y software. Por ejemplo, el tratamiento de datos es complejo, debido al tiempo de adquisición más prolongado y a un alto volumen de datos. Por otra parte, la temperatura dentro del incubador se eleva debido a un funcionamiento prolongado del sistema de monitorización; los efectos de dichos cambios ambientales deben ser considerados a nivel de las células.

Para alcanzar simultáneamente la fiabilidad de los datos y evitar los riesgos antes mencionados, el sistema CM30 cuenta el número de células a partir de múltiples puntos temporales (Figura 1), que se definen por el tamaño del recipiente en cada punto temporal, para luego estimar el estado del cultivo de todo el recipiente a partir de la media de los resultados analíticos. Esto permite que el sistema CM30 adquiera de forma eficaz los datos cuantitativos con un mínimo margen de error a partir de las condiciones actuales del cultivo.

En esta publicación, se exponen los resultados de la adquisición de datos cuantitativos llevada a cabo con el sistema CM30, para compararlos y verificarlos* a fin de confirmar la validez del estado celular estimado del completo reciente de cultivo a partir de múltiples puntos.

*En esta publicación se presentan los resultados obtenidos a partir de una verificación interna realizada por Evident.

Figura 1. Número de puntos en la observación multipunto a partir de diferentes recipientes de cultivo celular.
 

Verificación comparativa de los estimados del cultivo celular

Para la validación, se usaron los siguientes tipos de células y cultivos celulares a fin de comparar los resultados analíticos en el recuento celular.

Tipo de célula, cultivo celular (número de puntos en la observación multipunto)

• A549, placa de 12 pocillos（9 puntos por pocillo)
• NHEK, frasco/matraz T75（25 puntos)

Se aplicaron de forma específica los mismos parámetros analíticos al recipiente completo y a cada uno de los múltiples puntos de observación definidos para cada recipiente en el sistema CM30 en el mismo punto temporal; y, se compararon los resultados del recuento celular. Para comparar los resultados a través del completo proceso de proliferación celular, también se validaron los resultados en función de cada una de las tres densidades celulares: baja, media y alta.

La validez de la observación multipunto con el sistema CM30 se verificó al comparar el recuento celular del completo recipiente, estimado a partir de la media de los recuentos celulares analizados en múltiples puntos definidos para cada recipiente, con el recuento celular estimado al observar el recipiente completo como el valor real en el caso de las tres densidades previamente mencionadas.

Para verificar el grado de variación entre los recuentos celulares, al estimar el completo recipiente a partir de un solo punto de observación, se compararon los recuentos celulares del completo recipiente estimados a partir de los recuentos celulares máximo y mínimo —en el punto de observación obtenido por la anterior observación completa— con los recuentos celulares en curso (valores reales) en torno al recipiente completo.
 

Importancia de las observaciones multipunto con un sistema de monitorización de incubación

La Figura 2 muestra una comparación de los recuentos estimados (valores reales) para el recipiente completo y el recuento obtenido a partir de las observaciones multipunto en la placa de 12 pocillos y el frasco/matraz T75.

Figura 2. Error en la estimación del recuento celular entre el recipiente completo y la observación multipunto.

Por lo general, el recuento (o conteo) celular y el análisis de confluencia se ejecutan a nivel de las inspecciones de calidad durante el proceso de preparación celular con una exactitud de ±10 % el valor real. En tal validación, ya sea en el caso de la placa con 12 pocillo o el frasco T75, el error entre el recipiente completo y la estimación basada en la observación multipunto se encuentra a ±2 % a través de todo el proceso de crecimiento.

Por tanto, se halló que las estimaciones obtenidas a partir de las observaciones multipunto de cada recipiente proporcionaron suficientes datos fiables sin necesidad de observar el recipiente completo. Incluso bajo condiciones difíciles, como una placa de 12 pocillos con una pequeña cantidad de puntos de observación por área de recipiente, el error en los valores estimados para el recipiente completo se encontraba entre ±2 % con respecto al completo proceso de crecimiento. Por consiguiente, el número de múltiples puntos del sistema CM30 se consideró suficiente para estimar la condición celular el recipiente completo.

Además de validar la observación multipunto, se verificó el mismo método al contar el número de células en un solo punto de observación a nivel del recipiente, y se estimó el estado celular del completo recipiente en función de los resultados (Figura 2). Se halló lo siguiente: un error de recuento de hasta el 60 % en el caso de la placa de 12 pocillos y un error de recuento de hasta el 129 % en el caso del frasco/matraz T75.

Para saber si este resultado estaba asociado a un cultivo celular irregular, se usó un mapa térmico del grado de variación en el recuento celular, a partir de los recipientes, en el frasco/matraz T75 (Figura 3). El color amarillo indica áreas celulares con más de 25 % de células a diferencia del completo recuento celular promedio; la luz azul indica áreas con menos de 25 % de células. La línea roja indica el área de observación multipunto CM30 (frasco/matraz T75); el anaranjado indica el área donde la mayoría de las células han sido detectadas, y el azul indica el área en la que menos células se detectaron.

Los resultados de la verificación muestran que incluso un operador un tanto capacitado, quién rutinariamente realiza cultivos celulares, puede experimentar en parte este tipo de variaciones de cultivo. También, muestran que el riesgo de la estimación completa es muy alta si un solo punto de observación es cubierto por un área que se desvía a partir del recuento celular promedio del recipiente completo.

Figura 3. Mapa térmico que muestra el grado de variación en los recuentos celulares en un frasco/matraz T75.

Dado que las irregularidades de cultivo ocurren en ciertos niveles, tal y como se visualiza anteriormente, estimar el estado celular del recipiente completo a partir de un solo punto de observación conlleva a un alto riesgo con respecto a la obtención de resultados que difieren de forma significativa del recuento celular en curso, incluso si no hay problemas mayores asociados a la operación del cultivo celular por parte del operador. Esto demuestra que es difícil obtener datos cuantitativos a partir de un solo punto de observación con alta reproducibilidad. Por ejemplo, al usar un dispositivo de monitorización que se limita a un solo punto de observación, es necesario observar múltiples puntos mientras se mueve en cada momento la posición del recipiente para poder cuantificar el estado celular del recipiente completo.
 

Conclusión

Nuestra validación comparativa del sistema CM30 muestra que es posible estimar datos cuantitativos cercanos al recuento celular en curso del recipiente completo a partir de la media de los recuentos celulares ejecutados desde múltiples puntos sin observar el recipiente completo. Esto demuestra la validez de la estimación del recipiente completo a partir de múltiples puntos. Además, si se considera que hay cierta cantidad de irregularidades que pueden generarse en el cultivo, incluso cuando su tratamiento lo ejecuta un operador un tanto calificado, estimar el recuento celular del recipiente completo a partir del punto de observación presenta un alto riesgo con respecto a la obtención de datos que son significativamente diferentes de aquellos del recuento celular en curso.

Los resultados de este estudio sugieren que los datos cuantitativos obtenidos por una observación multipunto en el sistema CM30 es fiable para el control de calidad de células. También precisan que, incluso al verificar de forma simple la condición celular, es importante considerar un cierto grado de irregularidad de cultivo y ejecutar una observación multipunto.

Aparte de los métodos analíticos mencionados anteriormente, el sistema CM30 ha sido actualizado con el fin de mejorar el recuento celular, la confluencia y otras funciones analíticas. La exactitud de los análisis de IA también han sido mejorados al adicionar más situaciones detalladas dedicadas a cada parámetro analítico. Puesto que el sistema CM30 se centra en la eficiencia y reproducibilidad cuando se trata de monitorizar de forma cuantitativa las condiciones de cultivo y busca minimizar la variabilidad creada por cada operador, es una solución óptima para el proceso de cultivo celular que conlleva a un gran número de tareas diarias.
 

Autor

Masatoshi Dehari
Soluciones de investigación en ciencias de la vida, Marketing mundial
Evident