Sistema de detección SilVIR de última generación para el microscopio confocal láser FLUOVIEW FV4000

Resumen

Evident es pionero en el desarrollo patentado del sistema de detección SilVIR de última generación para sus microscopios confocales láser FV4000. Este detector define un nuevo referente en el procesamiento de imágenes multicromático, que ofrece un nivel de ruido extremadamente bajo y una altísima sensibilidad manteniendo a la vez una impresionante relación entre la señal y el ruido a través de todo el rango de longitudes de ondas, desde la región visible hasta el infrarrojo cercano. Gracias a su capacidad para detectar fotones correctamente, mediante el recuento de fotones de alto rango dinámico y de alta velocidad, el detector SilVIR permite asegurar la repetibilidad experimental. Además, aporta una experiencia operativa agilizada, ya que elimina la necesidad de ajustar los parámetros de ganancia que se requieren cuando se usan detectores PMT. Su excelente rendimiento encamina al detector SilVIR a devenir el nuevo estándar industrial en la microscopía de escaneo láser.
 

1. Introducción

Los tubos fotomultiplicadores (PMT), usados para detectar luz débil a través de varios niveles fotónicos con alta sensibilidad y ganancia, han sido los detectores estándar en la microscopía de escaneo láser (LSM, sigla en inglés) para capturar luz fluorescente muy tenue. No obstante, existen numerosos problemas asociados al uso de estos dispositivos en la LSM, los cuales serán explicados en las siguientes secciones.

El sistema de detección SilVIR usa un sensor de tipo semiconductor para detectar la fluorescencia. Este fotomultiplicador de silicio (SiPM) elimina varios problemas y limitaciones experimentados con los PMT convencionales. El circuito de procesamiento de señales también posee tecnología que maximiza las capacidades del sensor, lo que expande su aplicación a un procesamiento de imágenes de elevado número de píxeles y alta velocidad (ver Figura 1).

En este artículo, se explican los problemas que pueden sobrevenir con el procesamiento de imágenes convencional en la LSM al usar detectores PMT, y cómo pueden ser solucionados con el detector SilVIR.

_{Figura 1. Dispositivos que componen el detector SilVIR: (a) detector de fluorescencia FV4000; (b) gráfico que muestra la sensibilidad espectral del detector SilVIR [el detector presenta una sensibilidad más elevada que los PMT GaAsP convencionales de alta sensibilidad —de 400 nm a 900 nm— usando un tipo de banda ancha y desplazamiento hacia el rojo]; (c) el detector SilVIR se compone de un sensor SiPM, con capacidad de muestreo de señal por conversión A/D de 1 GHz, y un procesamiento de la señal digital.}
 

2. La creación de un mejor detector para las necesidades del escaneo láser

Entre las quejas más frecuentes de los usuarios de la LSM, destacan:

• La confusión sobre qué ajuste debe ser determinado para maximizar el rendimiento del dispositivo.
• El fotoblanqueamiento y la fototoxicidad excesiva.
• La saturación de los detectores involuntaria.
• La necesidad de una calidad, resolución y refresco de imágenes superiores.
• La imposibilidad para adquirir mejores imágenes.

El motivo de estas quejas es el detector PMT y su principal método de funcionamiento. A continuación, se dan a conocer algunos de los factores que fueron considerados para crear un mejor detector.

Alta sensibilidad y relación entre señal-ruido (S/N)

Para detectar de forma eficiente hasta una pequeña cantidad de fotones incidentes, tal como se requiere en el procesamiento de imágenes con señales fluorescentes débiles, es esencial que el detector se dote de una alta eficiencia cuántica (QE) y de detección fotónica (PDE). Además, el ruido intrínseco del circuito entre el sensor y el detector debe ser mínimo para poder alcanzar una óptima relación entre S/N.

Cuantificación de la luz detectada

Si bien existen varias definiciones sobre cómo medir físicamente la luz detectada, la cuantificación del «número de fotones» es la forma más adecuada de cuantificar la luz fluorescente demasiado débil. Por tanto, la manera más simple de medir la intensidad es a través del número de fotones detectados (Figura 2).

Cuantificar la intensidad de fluorescencia con un valor numérico es importante. Por ejemplo, con ello es posible reproducir los mismos resultados del procesamiento de imágenes en diferentes instrumentos, ya que el valor no es específico del dispositivo. Asimismo, puesto que el valor del número de fotones es universal, los investigadores pueden compartir sus datos de forma más clara entre ellos. Por último, los valores cuantitativos pueden usarse como indicadores para el procesamiento de imágenes durante el análisis.

_{Figura 2. Proceso de detección de fluorescencia que inicia cuando los fotones inciden en la superficie del sensor fotónico. Tras ello, los fotones detectados son convertidos en electrones y amplificados, llegando a producirse como corriente eléctrica. La corriente pasa por una conversión analógico-digital tras pasar por el circuito de amplificación. Después, la señal digitalizada deviene un valor de intensidad para cada píxel por medio de un procesamiento aritmético y el software la visualiza como cada píxel en la imagen.}

Alto rango dinámico

A pesar de que los factores antes mencionados pueden llegar a alcanzarse, resulta que si el número máximo de fotones detectados en un momento dado —conocido como rango dinámico— es pequeño, se producirá una saturación de intensidad en las regiones en las que la intensidad de fluorescencia es alta, lo que llevará a la pérdida de los datos cuantitativos. Por otra parte, una de las formas de mejorar la calidad de la imagen es suprimir el ruido de los fotones (el ruido probabilístico proveniente de la detección de fotones por el sensor, también conocido como ruido de accionamiento), lo que aumenta la emisión de fotones con fuerte excitación. Es posible capturar imágenes de alta calidad sin saturar el brillo cuando el rango dinámico es alto. Por ejemplo, en la Figura 3, cuanta más luz fluorescente se detecte a partir de la excitación superior de la derecha, mejor será la calidad de la imagen. Sin embargo, a la larga, la saturación de los detectores comprometerá muchos pasos de análisis y posprocesamiento.

Ganancia coherente del detector para cuantificar la imagen

Es ideal contar con un alto rango dinámico para evitar cambiar las condiciones del detector o circuito. Por ejemplo, al cambiar la ganancia del detector para ampliar el rango superior, la intensidad resultante de la imagen también variará. Sin embargo, esta relación no es lineal; por tanto, resulta difícil estimar inversamente la cantidad de luz detectada únicamente a partir de la imagen obtenida. Y, se debe preparar una curva de calibración por separado para su corrección. Los gráficos de líneas de la Figura 3 muestran el perfil de brillo a través de la línea A en cada imagen. Cuando estas imágenes son obtenidas mediante una configuración de detector fija, los números de fotones detectados en cada píxel pueden ser estimados de forma cuantitativa a partir de la intensidad de cualquier imagen.

_{Figura 3. Relación entre la intensidad de fluorescencia y la calidad de imagen. La relación entre señal-ruido se determina por la intensidad de la fluorescencia/√intensidad de fluorescencia.}
 

3. Problemas del detector PMT convencional en el procesamiento de imágenes para la LSM

A continuación, se cubren los problemas principales al utilizar un detector PMT para la microscopía de escaneo láser.

Es difícil lograr una alta sensibilidad a la vez que una óptima relación entre señal-ruido.

Hoy en día, es común usar tubos fotomultiplicadores de tipo fotocatódico GaAsp [1], cuya QE en el rango visible ha mejorado un 40 % o más, como detector de alta sensibilidad. Puesto que hay ruido proveniente de los sensores y circuitos, por lo general, este sensor ha sido usado para amplificar la señal con una mayor ganancia a fin de prevenir que el ruido relativo afecte la imagen. El detector PMT también convierte los fotones en electrones a nivel de la superficie de recepción de la luz, para luego emprender un proceso de amplificación estocástico de múltiples pasos a fin de generar una señal de corriente (Figura 4). Por tanto, no importa si el número de fotones detectados es constante, la salida eléctrica cambiará cada vez debido a la fluctuación estocástica. Esto puede empeorar la relación entre señal-ruido de la imagen, en particular cuando se trata de un procesamiento de imágenes con altos valores de velocidad y píxeles, pero con menos fotones detectados.

_{Figura 4. Estructura de una de las características de entrada-salida del detector PMT. Si los fotones inciden en el fotocátodo, los electrones emitidos a partir de este último serán amplificados en un tubo de vacío. A medida que los electrones secundarios se amplificarán de forma repetida en múltiples cadenas de dinodos, la señal del impulso de salida —al detectar un fotón— no se presentará uniforme ni estable.}

Baja cuantitatividad de intensidad para los fotones detectados

Como antes descrito, un sensor PMT tiene una variación estocástica durante la amplificación del fotoelectrón. Por tanto, la valoración cuantitativa de entrada/salida es baja, en particular cuando el índice de la detección fotónica es bajo. Además, si la ganancia se ajustase en función de la variación de tensión aplicada entre los electrodos, la relación correspondiente entre entrada y salida también variará. Por tanto, la ganancia en curso variará enormemente entre cada PMT debido a diferencias individuales sin importar el tipo de tensión aplicada. Y, si la tensión aplicada se determinase a un nivel bajo para amplificar grandes cantidades de fotones, la linealidad empeorará.[1]

Y, hay más. Los fenómenos inevitables que se describen a continuación deteriorarán la sensibilidad del PMT en función de los fotones detectados y acumulados por el uso.

• Emisión de los electrones a partir del fotocátodo —tras el ingreso de los fotones en este último— hacia un tubo vacío (válvula) debido al efecto fotoeléctrico externo. El fotocátodo se deteriora, ya que los electrones no pueden ser recargados.
• Degradación de los dinodos debido al impacto con los electrones (fotoelectrones) emitidos a partir del fotocátodo.
• Deterioración del fotocátodo o de los dinodos debido al impacto con los iones que se generan a partir de la colisión entre fotoelectrones y el gas residual o impurezas provenientes del tubo vacío.
• Disminución del vacío debido a las impurezas generadas por los dinodos a partir de la colisión de los fotoelectrones y dinodos.

Por los motivos antes descritos, la microscopía de escaneo láser (LSM) que usa tubos fotomultiplicadores no puede proporcionar una valoración cuantitativa (cuantitatividad) entre la cantidad de luz detectada y la intensidad de la imagen.

Dificultad para lograr un alto rango dinámico a la vez que una óptima relación seña-ruido

No obstante, si se incrementa la ganancia del sensor, todavía es posible detectar una señal débil de algunos fotones a pesar del ruido, lo que permitirá lograr una buena relación entre señal-ruido. Pero, el límite superior de la corriente de salida del PMT es tan bajo como varios μA. Y, si se determina la ganancia a un nivel alto, la salida se saturará fácilmente, incluso a partir del pequeño número de fotones detectados, lo que facultará tan solo un rango dinámico pequeño (Figura 5a). En el caso contrario, si se determina la ganancia a un nivel bajo, la señal de salida no presentará una saturación equilibrada cuando la fuerte fluorescencia (un gran número de fotones) sea detectada, y se mantendrá el rango dinámico alto; mas, la fluorescencia débil, como varios fotones, no se amplificará y se perderá en el ruido, lo que causará una relación entre señal-ruido deficiente (Figura 5b). Como resultado, el usuario requerirá ajustar manualmente la ganancia del detector en función de la iluminación aplicada al objeto y el nivel de calidad de imagen requerido. Hay también una desventaja, ya que el rango dinámico y la relación entre señal-ruido se ven modificados de forma involuntaria debido a este ajuste.

_{Figura 5. Ajustar la ganancia de un PMT requiere equilibrar la relación entre señal-ruido, así como el rango dinámico. (a) Alta ganancia: La señal de salida puede ser amplificada a un valor más alto que el ruido al detectar un fotón; pero el rango dinámico se reduce y es fácil que se produzca saturación. (b) Baja ganancia: La señal de salida no puede distinguirse a partir del ruido cuando se detectan unos pocos fotones. Por otra parte, el rango dinámico es más alto, y no se satura cuando se detecta un gran número de fotones.}

Parámetros de detección complejos

Ajustar la configuración del detector, con el fin de obtener una calidad de imagen satisfactoria, evitando la saturación del brillo, es complejo; esto plantea una dificultad para los usuarios principiantes en LSM. Con fines aclaratorios, la Figura 6 muestra microesferas fluorescentes con diferentes intensidades de fluorescencia provocadas por las diferentes configuraciones a nivel de la ganancia del detector.

La Figura 6a muestra las microesferas bajo diferentes excitaciones adquiridas con alta ganancia. Las microesferas oscuras apenas pueden distinguirse a partir del ruido, incluso con una excitación débil (imagen al extremo izquierdo de la figura); sin embargo, las microesferas brillantes se saturaron con el aumento de la luz de excitación (las dos porciones de microesferas brillantes a la derecha de la figura).

Por otro lado, la Figura 6b muestra las mismas imágenes de microesferas fluorescentes adquiridas por medio de una menor ganancia. La señal de las microesferas oscuras bajo excitación débil (las dos en el lado izquierdo del diagrama) son cubiertas por el ruido. Puede que sea superior a la ganancia alta; ya que las microesferas brillantes no se saturaron incluso cuando la excitación se configuró al nivel más alto (extremo derecho en el diagrama). Pero, no hay una mejor relación señal-ruido (S/N) que la imagen al extremo derecho de la Figura 6a (imagen capturada por alta ganancia) al enfocar la relación S/N de las microesferas oscuras.

Las imágenes fluorescentes típicas provenientes de muestras celulares presentan diferencias de brillo significativas según la región; y, las imágenes obtenidas en intervalo o por apilamiento Z pueden incluir diferencias de brillo aún mayores a través de todo el apilamiento. Por tanto, incluso para usuarios experimentados, es difícil encontrar la óptima configuración del detector a fin de obtener imágenes con una relación S/N satisfactoria en áreas oscuras sin saturar las áreas brillantes. Muchos usuarios llevan a cabo ajustes de prueba-error con respecto a la ganancia del detector, la intensidad de la luz de excitación, la duración de la exposición, etc. Esto conlleva a que el especialista obtenga muchas imágenes erróneas.

Si la relación entre S/N es apropiada gracias a los parámetros del detector que no causan saturación, dicha relación puede mejorarse al capturar múltiples fotogramas y promediarlos o acumularlos para suprimir sólo el ruido disperso. En dicho caso, es necesario capturar muchos fotogramas, lo que resultará en una frecuencia de fotogramas en importante decaimiento a nivel del procesamiento de imágenes en curso.

Tal y como se ha mencionado previamente, al usar los detectores PMT en la LSM convencional, se requiere ajustar parámetros complejos para el procesamiento de imágenes, como es el caso de la ganancia del detector, la intensidad de la luz de excitación, la duración de la exposición, como también los intervalos promediados entre cada fotograma.

_{Figura 6. Ajustar la ganancia de un PMT requiere equilibrar la relación entre señal-ruido, así como el rango dinámico; esto puede resultar difícil. Las imágenes fueron adquiridas a través de diferentes configuraciones de láser de excitación; las imágenes de la derecha fueron adquiridas usando una configuración de valor más elevado. Los gráficos debajo de las imágenes muestran el perfil de intensidad a lo largo de la línea A. La relación entre señal-ruido es la relación entre S (la altura del perfil) y Ns (ruido de fotones) y Nd (ruido del circuito). La Figura 6a expone las muestras adquiridas con alta ganancia. Las esferas tenues presentan una relación entre señal-ruido (S/N) más elevada; sin embargo, las esferas más brillantes se saturan. La Figura 6b expone las muestras adquiridas con baja ganancia. Las esferas tenues presentan una relación entre señal-ruido más baja; pero, las esferas más brillantes no se saturan.}

Problemas con el circuito de detección

Tanto como los sensores, el circuito de detección también plantea problemas. Dado que la señal del sensor y su circuito amplificador son ruidosos, la relación entre S/N deviene deficiente cuando la señal sin procesar, muestreada por los convertidores analógico-digital (AD), es tratada como datos de píxeles (Figura 7a, izquierda). Por lo general, esta relación entre ruido-señal (S/N) puede optimizarse para que sea equivalente al valor real de la intensidad fluorescente al muestrear la señal después de suavizarla con un filtro de paso bajo o un integrador en el circuito de detección analógico (Figura 7a, derecha). Sin embargo, cuanto más rápida sea la velocidad de escaneo, como en el caso de un escáner resonante, menor será el tiempo que se requiera para atravesar la estructura de la muestra. La Figura 7b muestra la imagen fluorescente de la misma estructura que aparece en la Figura 7a, a excepción de que está escaneada con el doble de velocidad en comparación con la Figura 7a. Si se aplica un filtro de paso bajo dedicado a reducir el ruido de la misma manera, la resolución temporal para resolver las estructuras finas con alta frecuencia espacial será insuficiente y la resolución espacial de la imagen resultante se degradará (Figura 7b, derecha).

Si la frecuencia de corte de los filtros de paso bajo aumenta, la resolución temporal mejorará. Sin embargo, la eficacia con respecto a la supresión de ruido se degradará y la relación S/N se deteriorará. Para evitar la degradación de la relación S/N, a pesar de haber aumentado la frecuencia de corte de los filtros de paso bajo, es necesario aumentar la frecuencia de muestreo de los convertidores de señal analógica a digital (A/D) de varias veces a varias decenas de veces el reloj de píxeles con el fin de ejecutar un gran número de muestreos dentro de un píxel (sobremuestreo). Además, la velocidad de escaneo más rápida y el número más alto de píxeles acortan la duración de un píxel; por tanto, se requiere una velocidad de muestreo más rápida de los convertidores A/D.

En el caso del suavizado de ruido, se presenta otro problema en lo que respecta al circuito analógico, ya sólo puede adoptar un filtro simple (como un filtro de paso bajo) a expensas de la resolución temporal. Se espera que se desarrolle un método de filtrado que separe sólo el ruido sin privar la resolución temporal mediante la aplicación de avanzados filtros de procesamiento de señales digitales en datos muestreados a alta velocidad.

_{Figura 7. Efecto de reducir el ruido sobre la calidad de la imagen y la resolución espacial. La figura 7a fue capturada a una velocidad de escaneo estándar y la calidad de la imagen se optimizó con la reducción del ruido. La Figura 7b fue capturada a una velocidad de escaneo dos veces más rápida que la utilizada en la 7(a): puede verse que la resolución espacial se degrada debido a la disminución del ancho de banda de la señal.}

Los problemas de imágenes anteriores que se plantean en la LSM por causa de los PMT pueden resolverse con nuestro detector SilVIR. Éste combina un nuevo sensor SiPM de tipo semiconductor que ofrece un muestreo digital de alta velocidad. En la siguiente sección, se explicará cómo resolver los problemas antes mencionados con nuestras tecnologías avanzadas.
 

4. Introducción técnica al detector SilVIR

4-1. Características del sensor SiPM

El sensor SiPM, que forma el núcleo del detector SilVIR, es un sensor semiconductor compuesto por una matriz bidimensional de miles de fotodiodos de avalancha (APD; fotodiodo de avalancha por recuento de fotón individual o SPAD) en modo Geiger. Las señales detectadas se emiten como la suma de todos los APD [2] (Figura 8).

El modo Geiger permite detectar la incidencia de un fotón por medio de altos niveles de señal a través de un proceso de multiplicación altamente estable a pesar de la alta ganancia. Además, el proceso de fabricación de semiconductores permite un control preciso sobre las variaciones individuales de los SiPM. Las diferencias entre la eficiencia de la detección fotónica (PDE) y la ganancia a nivel de los SiPM, a través de una producción de masa uniforme, pueden minimizarse en gran medida. Además, no importa si muchos fotones inciden al mismo tiempo, la suma de las respectivas corrientes APD es dada a partir del SiPM; por ello, el límite superior de la corriente de salida es alto, lo que resulta en un amplio rango dinámico que permite detectar una gran cantidad de fotones incidentes. En otras palabras, la señal de un fotón puede multiplicarse con alta ganancia y cubre un amplio rango de detección. Gracias a ello se logra una óptima relación entre señal-ruido y un amplio rango dinámico de forma simultánea, lo que elimina la necesidad de comprometer uno de los dos al ajustar la ganancia.

Además, la conversión fotoeléctrica mediante un SiPM, como los fotodiodos, utiliza el efecto fotoeléctrico interno que consiste en excitar los electrones desde la banda de valencia hasta el conductor. Por consiguiente, los electrones se recargan rápidamente cuando son excitados. Esto da como resultado una sensibilidad y ganancia que no se degradan, incluso frente a una gran cantidad de luz incidente.

_{Figura 8. Estructura de un sensor fotomultiplicador de silicio (SiPM) y sus características de entrada-salida. La Figura 8 (a) muestra que un SiPM se compone de un APD multipíxel. Cuando un fotón incide en la superficie receptora de fotones del APD, la señal de corriente sale por medio de la conversión fotoeléctrica interna seguida de una amplificación de electrones de avalancha en la capa de avalancha. La Figura 8(b) muestra que cuando múltiples fotones inciden de forma simultánea, la señal de salida es la suma de la señal APD. La forma de la onda de salida del APD en respuesta al fotón detectado es constante y estable.}  

El sensor SiPM también presenta excelentes características de sensibilidad. La Figura 1b muestra la sensibilidad espectral del sensor SiPM. Cuando se usa una combinación de sensores SiPM y diferentes sensibilidades espectrales, a lo que se denomina detector de silicio de banda ancha (BSD) y detector de silicio con desplazamiento hacia el rojo (RSD)—, es posible alcanzar una mejor sensibilidad que con un detector PMT GaAsP en el rango de la longitud de escala visible (400 nm) hasta la del infrarrojo cercano (900 nm). La eficiencia de la detección fotónica (PDE) del SiPM se define por la siguiente ecuación:

PDE = QE × FF × PA

QE: Eficiencia cuántica
FF: Eficiencia de apertura (factor de relleno)
AP: Probabilidad del modo Geiger (probabilidad de avalancha)

El parámetro de FF se determina en función del área del APD en la superficie receptora de fotones SiPM con respecto al área de la zona muerta entre los píxeles del APD. El valor de la AP depende del voltaje aplicado al sensor SiPM: cuanto mayor sea el voltaje, mayor será la PDE que puede ejecutarse. Por otra parte, si se aumenta el voltaje aplicado aumentará también el ruido del sensor. Por ejemplo, en el modelo S13360-3050 fabricado por la empresa Hamamatsu Photonics, la PDE puede incrementar en torno a 1,4 veces cuando se aumenta el sobrevoltaje (voltaje aplicado por encima del voltaje de ruptura) de 3 V a 7 V; sin embargo, el ruido en el recuento bajo oscuridad incrementa de casi dos veces, el ruido de diafonía de más de dos veces y el ruido posterior al pulso de más de tres veces [2]. Este ruido incrementado contrarrestará los beneficios aportados por el incremento de la PDE; por tanto, no mejorará la relación entre S/N. Además, aumentar el ruido dificulta en gran medida la valoración cuantitativa de la detección de fotones, que es uno de los principales beneficios de los SiPM. Por otra parte, dado que la ganancia también aumenta en un factor de dos o más, el rango dinámico de detección se reduce. Un ejemplo ilustrativo de los posibles peligros que se plantean al centrarse únicamente en los valores altos de la PDE o QE sirve como recordatorio para evitar perseguir ciegamente tales parámetros, ya que pueden producir inconvenientes. Por tal razón, el microscopio confocal FV4000 emplea un sensor SiPM con óptima sobretensión que permite alcanzar un nivel de ruido y una sensibilidad equilibrados, así como un rango dinámico excepcional para detectar fluorescencia.

A menudo se indica como una desventaja que un SiPM posea un nivel de ruido en el recuento bajo obscuridad superior a un PMT. Como contramedida, la superficie receptora de fotones se enfría a aproximadamente –20 °C (–4 °F) para reducir el ruido en el recuento bajo oscuridad para que se halle entre varios kilocuentas y varias decenas de kilocuentas por segundo. Sin embargo, esto sigue siendo superior al PMT enfriado. No obstante, cuando se usa un SiPM con un ruido en el recuento bajo oscuridad de 10 kilocuentas por segundo a fin de escanear 512 píxeles/línea —con una duración de 2 µs/píxel—, se aprecia un ruido en el recuento bajo oscuridad equivalente a 1 fotón en sólo unos 10 píxeles por línea. Con esta cantidad, no se aprecia un impacto significativo a nivel de la calidad de la imagen en la LSM.

Otra desventaja de utilizar un SiPM como detector en la LSM es que puede permanecer una degradación prolongada en la señal de salida (Figura 8). Esto causa un problema en las imágenes de alta velocidad; sin embargo, como se describe en la siguiente sección, hemos abordado este problema con éxito a través de la implementación de una solución innovadora de circuitos de detección.

4-2. Funciones para el muestreo y el procesamiento digital de alta velocidad

En función de lo descrito anteriormente, los sistemas convencionales equilibran la relación entre señal-ruido y la resolución temporal al combinar un suavizado de señal por medio de un filtro en el circuito analógico, con la frecuencia de muestreo de la señal A/D mínima necesaria (período de muestreo de cerca la mitad del período de píxel) para la resolución de píxeles. Sin embargo, esta solución presentaba limitaciones técnicas en cuanto a satisfacer el número de píxeles más elevado (duración de píxel más corta) por el escáner resonantes de alta velocidad (Figura 9a).

Muestreo de señal analógica a digital (A/D) de alta velocidad

Producimos entonces una frecuencia de muestreo A/D de 1 GHz, que es 12 veces más rápida que la frecuencia de muestreo convencional, y se adoptó un método de sobremuestreo en el que se aplica una gran cantidad de muestreo dentro de una duración de píxel. Dado que la salida de un sensor SiPM se dota de un amplio rango dinámico, el rango de su señal de salida también es muy grande en comparación con un PMT. Conjugada con una mayor frecuencia de muestreo A/D, la precisión de la resolución de amplitud es 16 veces mayor (de 10 bits a 14 bits) que la de los dispositivos convencionales. Nuestros dispositivos de alto rendimiento están optimizados para aplicaciones de procesamiento de señales SiPM. El aislamiento de ruido usa un filtro de procesamiento de señal digital en lugar de un filtro de circuito analógico; éste atenúa eficazmente el ruido, a la vez que reduce el ofrecimiento del ancho de banda de la señal para lograr una mejor relación entre S/N. Como resultado, los componentes de alta frecuencia que no podían separarse con el método convencional ahora pueden detectarse por separado, y es posible alcanzar una resolución de píxeles adecuada (resolución temporal), incluso si el número de píxeles del escáner resonante es 1k o mayor (Figura 9b).

_{Figura 9. Efecto de una reducción de ruido optimizada sobre la calidad de la imagen y la resolución espacial. La Figura 9(a) muestra el método convencional usando un filtro de circuito analógico y un muestreo de baja velocidad; la resolución espacial se degrada debido al decaimiento del ancho de banda de la señal cuando el escaneo es rápido. La Figura 9(b) muestra una combinación de muestreo de alta velocidad y reducción de ruido, habilitada por el filtro digital, durante un escaneo de alta velocidad, a la vez que se mantiene la resolución espacial.} 

Transformación inversa instantánea en la serie de puertas programables en campo para eliminar el decaimiento de la señal

Hemos desarrollado también una técnica que permite restaurar la degradación del ancho de banda producida por el lento decaimiento de la señal (una desventaja en los sensores SiPM), por medio de un procesamiento de señal avanzado en la serie de puertas programables en campo (FPGA) sin límites. Cabe resaltar que existe una técnica para eliminar la señal en decaimiento: un método de restablecimiento de fuerza conocido [3]. Sin embargo, nuestra técnica puede restaurar la señal de salida a una velocidad más alta sin el complejo circuito de detección que requiere la técnica convencional.

No obstante, a pesar de que un sensor SiPM puede indicar el tiempo de detección de fotones y el número de fotones detectados de manera exacta y rápida, existe una desventaja: una señal de salida que decae lentamente. Cuando se procesan imágenes con un escáner resonante, la duración de la permanencia de los píxeles provoca la fuga de una señal en decaimiento en los píxeles adyacentes; esto degrada la resolución de los píxeles y la resolución temporal (Figura 10a).

Si se usa una SiPM, la salida de la señal total es la suma de las salidas de señal de cada APD; se crea además una forma de onda a partir del impulso de respuesta de salida tras la incidencia de fotones de cada APD, con una estabilidad y mantenimiento de su forma constante en comparación a un detector PMT. Si la respuesta a la entrada puede definirse unívocamente, la salida final puede obtenerse al sumar la convolución de la respuesta a la entrada. Bajo el supuesto de que el tiempo de detección de fotones y su número son x(t) en la Figura 10b y la respuesta del sensor es h(t), la salida y(t) es;

y(t)=(x*h)(t)=∑x(i)h(t-i)

Cuando se mide la señal de salida SiPM y(t), incluida la señal en decaimiento, en el caso de que se defina la respuesta del sensor h(t), el evento de detección de fotones x(t) que no porta una señal en decaimiento puede calcularse ejecutando esta transformación inversa. Esto se basa en el mismo concepto que un filtro de deconvolución [4], a menudo aplicado para eliminar la cola de la forma de onda de la señal, por ejemplo, al analizar señales de descarga provenientes de la dinámica de iones de calcio —de forma cuantitativa en el campo de la neurociencia. La FPGA cuenta con un procesador de señal digital (DSP) avanzado de alta velocidad que permite el procesamiento instantáneo de los cálculos de la transformación inversa dentro del dispositivo. De hecho, hemos desarrollado una técnica para obtener los datos de salida de la señal del sensor transformada inversamente en la FPGA instantánea [5], tal y como se muestra en la Figura 10c.

Al calcular la intensidad de los píxeles por medio de esta secuencia de datos transformada inversamente, se eliminó la fuga de la señal en decaimiento hacia los píxeles vecinos (como se muestra en la Figura 10a). Por otra parte, los filtros de restauración no solo eliminan la señal de decaimiento, sino que también aíslan los ruidos mixtos, que difieren de la respuesta original de detección de fotones. Esto mejora aún más la relación entre señal-ruido de la señal.

_{Figura 10. Descripción general de la técnica para restaurar la degradación del ancho de banda debido a la señal en decaimiento del SiPM. La Figura 10(a) muestra la señal en decaimiento del sensor y la degradación de la resolución espacial; la 10(b) muestra la relación de entrada y salida del sensor SiPM; y la 10(c) muestra la estimación de la señal de entrada por deconvolución.} 

Como se muestra en la Figura 11, si no hay una transformación inversa, la resolución de píxeles de la imagen se degrada por el efecto del decaimiento de la señal SiPM, en particular, durante el escaneo resonante de velocidad y resolución elevadas. Por otro lado, la aplicación de la transformación inversa restaura la resolución temporal sin perder la entrada de fotones; esto habilita la obtención de una imagen de escáner resonante de alta resolución (1024 píxeles/línea) sin perder la resolución especial y ni los fotones detectados.

_{Figura 11. Ejemplo que muestra una muestra capturada con y sin transformación inversa (Actina (BODIPY FL) en una célula BPAE; escáner resonante, promedio de 64: p. ej., 488 nm; emisión de 500 a 540 nm; misma potencia de excitación; UPLSAPO40x2/ A. N. de 0,95; CA 1 AU, 1024 × 1024 píxeles.}

Recuento de fotones de alto rango dinámico

Las señales de salida de SiPM sin tratar son más propensas a acumularse cuando ocurren eventos de detección de fotones a alta frecuencia, como la detección de más fotones antes del decaimiento de la señal (la línea azul en la Figura 11). Por tanto, para sacar provecho del alto rango dinámico de un SiPM, la escala de conversión del convertidor A/D debe ser superior a la amplitud de la señal de detección de fotones de alta frecuencia, contando además con el efecto de acumulación. Por otra parte, para llevar a cabo el proceso de transformación inversa con precisión, la amplitud de la señal de un fotón, que es la señal más pequeña, debe detectarse con una resolución fina. Por consiguiente, se requiere un conversor A/D de resolución más elevada para capturar amplitudes más pequeñas con una resolución más fina y amplitudes de acumulación más extensas. Además, la transformación inversa no es posible sin una resolución temporal muy alta, es decir, muchas secuencias de datos digitales adquiridas a altas velocidades de muestreo. Por lo general, los convertidores A/D con una frecuencia de muestreo de 1 GHz para dispositivos de alta velocidad presentan un grado de resolución de 8 bits. Sin embargo, hemos logrado este proceso de transformación inversa al usar convertidores A/D de alta capacidad dotados de una frecuencia de muestreo de 1 GHz, resolución de 14 bits (gradación de 16384) y un procesamiento a alta velocidad de los datos digitales de gran capacidad y rapidez, obtenidos por estos convertidores usando una FPGA superior.

La señal transformada inversamente (línea naranja de la Figura 11) se restaura manteniendo la resolución temporal al suprimir la señal de decaimiento. Al nivelar las señales acumuladas, es posible obtener la amplitud de salida del impulso (valor de pico de onda) correspondiente al número de fotones detectado. En otras palabras, cuando se detecta un fotón, se emiten impulsos con la misma amplitud. De forma similar, cuando se detectan dos fotones simultáneamente, se emiten impulsos con una amplitud dos veces mayor. Poco después, con fotones son detectados de forma simultánea, los impulsos se emiten con una amplitud que es un múltiplo entero de tal fotón. Por tanto, si se detectan N fotones en un cierto intervalo de tiempo, la integración temporal de estos impulsos emitidos puede obtenerse como la intensidad integrada de N veces el impulso en el momento de la detección de un fotón. Esta relación también es válida cuando un gran nombre de fotones es detectado dentro de un muy corto período de tiempo.

Por consiguiente, este método permite detectar la luz fluorescente de forma precisa, incluso cuando se detecta un gran número de fotones en un corto período de tiempo, con una relación entre S/N capaz de detectar fotones de forma discreta. Como medida práctica, puede detectarse hasta 1 gigafotón por segundo mediante esta relación entre S/N, sin saturación. Si bien el recuento convencional de fotones individuales (paralizado o no paralizado) [1] solo podía aplicarse a tasas de detección de fotones de baja frecuencia, la técnica actual logra un recuento de fotones de alto rango dinámico (HDR), cuya relación entre señal-ruido es comparable al recuento de fotones individuales, incluso cuando se obtienen imágenes de muestras muy brillantes a alta velocidad (Figura 12).

_{Figura 12. Relación entre la intensidad de excitación y la señal de salida. Por un tiempo determinado, es posible detectar un mayor número de fotones al aumentar la potencia de excitación. La señal de salida llega a saturarse a través de una tasa baja de fotones detectados cuando se usa un método de recuento de fotones convencional. El recuento de fotones HDR —ejecutado por el detector SilVIR— no se satura, incluso con una tasa de fotones incidentes de alta frecuencia. Las curvas gráficas del recuento de fotones individuales se calcularon con una resolución de par de impulsos de 1,2 ns.}

4-3. Ventajas del detector SilVIR

El sistema detector SilVIR es la fusión de un sensor SiPM con un procesamiento de muestreo digital a alta velocidad. En la sección anterior, se describió la detección de fluorescencia idónea en la microscopía de escaneo láser (LSM) y el estado de la LSM convencional; asimismo, se exploró cómo ésta se desvía del ideal. Sin embargo, se ha logrado una detección de fluorescencia para LSM casi idónea gracias al detector SilVIR.

Sensibilidad y relación entre señal/ruido de nivel elevado

Un sistema de detección idóneo debería poseer una alta eficiencia de detección de fotones (PDE) y eliminar todo ruido en el sensor o en el circuito eléctrico.

Al usar dos tipos de sensores SiPM, el detector SilVIR logra una eficiencia más alta de la detección fotónica tanto en el rango de la luz visible como en el del infrarrojo cercano sin compensaciones entre el rango dinámico ni la relación entre señal-ruido (S/N). Además, el ruido del accionamiento fotónico domina en el detector SilVIR debido a que el ruido del circuito eléctrico se anula a un nivel de fotón o menos, y la corriente oscura es casi desdeñable. Por tanto, la relación entre señal-ruido aproximada puede estimarse a partir del número de fotones detectados mediante la siguiente ecuación:

Relación S/N = N/√N = √N

N: número de fotones detectados

Dado que la relación entre señal-ruido (S/N) puede cuantificarse de forma más fácil, el número de fotones detectados puede ser un indicador útil para compartir y examinar imágenes, así como para reproducir la calidad de las imágenes en un experimento de imágenes diario.

Cuantitatividad de la intensidad de la fluorescencia detectada

Un detector idóneo permite asociar la cantidad de fluorescencia con la intensidad detectadas a través de una escala cuantitativa. Sin embargo, con la tecnología convencional, esta asociación no era clara ni estaba clara. El detector SilVIR puede cuantificar la cantidad de fluorescencia detectada usando una escala cuantitativa clara: el número de fotones.

Amplio rango dinámico

Un detector idóneo debería dotarse de un amplio rango dinámico para poder detectar desde un fotón hasta miles de fotones. Sin embargo, si se usa la tecnología convencional, el rango es limitado cuando la ganancia es alta y extenso cuando la ganancia es baja, lo que conlleva a obtener un equilibrio entre la señal y el ruido. La alta ganancia del detector SilVIR permite detectar fotones individuales, mientras que su amplio rango dinámico favorece la detección de miles de fotones en un corto período de tiempo.

Configuración de detección simple (ganancia fija)

Un detector no debería requerir ajustes de configuración engorrosos. Aun así, la tecnología convencional requiere que los usuarios ajusten continuamente la alta tensión (HV) dependiendo del brillo de la fluorescencia del objetivo. El detector SilVIR, por otro lado, solo requiere que los usuarios ajusten la velocidad de escaneo, el tamaño de píxel y el recuento (o promedio) de la integración de fotogramas.

Un histograma sobre la intensidad de una imagen, como el que aparece en la Figura 13, muestra que la señal fluorescente puede ser detectada de forma discreta y cuantitativa por el detector SilVIR con una óptima relación señal-ruido. En la Figura 13, la intensidad aparece en forma de picos de tipo peine y la intensidad proveniente de la mayoría de los píxeles se concentra en valores de intensidad que coinciden con estos picos. Cada pico corresponde al número de fotones detectados e identificados a partir del valor pico de la señal de impulso, tal y como se describe en la sección anterior. Por ejemplo, si el valor pico de la señal de impulso —detectada en un píxel determinado— es de solo un fotón, la intensidad del pico corresponde a 1 fotón; y, si el valor pico del impulso —detectado en un píxel determinado— es dos fotones, la intensidad del pico corresponde a dos fotones. De modo similar, aunque aumente el número de fotones detectados, el valor de intensidad se convierte en la posición máxima del fotón detectado. Dado que este proceso genera naturalmente una pequeña cantidad de ruido y errores, al detectar una gran cantidad de fotones, dichos errores se acumulan y los picos de peine son difíciles de resolver a alta intensidad. No obstante, como el ruido y los errores se reducen a valores más bajos que la intensidad de un fotón, el histograma puede mostrar picos de peine de los fotones detectados separadamente. De hecho, al simular la distribución de la intensidad, suponiendo que se presenta un ruido con una desviación estándar de aproximadamente 1/3 la intensidad de detección de un fotón, no se pueden resolver picos superiores a tres o cuatro fotones.

Por ende, un fotón —unidad cuántica de luz más pequeña— puede detectarse de forma separada al ruido con una buena relación entre señal-ruido. Esto significa que la intensidad de la imagen se compone únicamente de la intensidad correspondiente al número de fotones detectados en cada píxel, y el efecto del ruido contaminado puede obviarse o no reconocerse. En otras palabras, el detector SilVIR favorece la adquisición de imágenes con una óptima relación entre señal-ruido equivalente a la imagen obtenida por medio del método tradicional de recuento de fotones. Cabe resaltar que el detector SilVIR puede ejecutar una detección con una óptima relación entre señal-ruido incluso cuando se adquieren imágenes de fluorescencia con alta intensidad a alta velocidad, a diferencia del método tradicional de recuento de fotones que funciona bien solo cuando se detectan niveles bajos de fluorescencia a través de una exposición más prolongada. Estas características hacen de SilVIR un detector innovador para adquirir imágenes de fluorescencia de precisión.

Bajo el microscopio confocal láser FV4000, la intensidad que aparece en el eje horizontal de la Figura 13 puede convertirse en el número de fotones detectados, y pueden mostrarse en la imagen como alternativa al valor de intensidad. El número de fotones puede convertirse a partir del ancho que existe entre los picos de peine, ya que los picos están a intervalos iguales. Específicamente, el detector SilVIR está diseñado para ejecutar 32 conteos al detectar un fotón, mientras que en el recuento de fotones tradicional un fotón equivale a un conteo. Gracias a nuestro método, una imagen adquirida puede tener un cierto grado de gradación incluso cuando el número de fotones detectados es pequeño. Por tanto, al acumular o promediar imágenes con un número bajo de fotones, es posible mejorar la relación entre señal-ruido y evitar que la información del número de fotones quede olvidad sin un propósito entre el ruido o los errores.

_{Figura 13. Imagen de fluorescencia adquirida con el detector SilVIR del microscopio FV4000 y su histograma de intensidad de píxeles. El histograma de peine muestra la distribución de la frecuencia para detectar fotones de forma específica.}
 

5. Imágenes de ejemplo provenientes del detector SilVIR

En esta sección se presentan imágenes de LSM, capturadas con el detector SilVIR.

Comparación con imágenes capturadas usando un detector PMT GaAsP

La Figura 14 muestra imágenes de fluorescencia verde capturadas por los detectores SilVIR y PMT GaAsP. La muestra fue expuesta a una excitación de igual potencia láser para lograr una intensidad de fluorescencia típica. Con una intensidad relativamente fuerte (alrededor de 128 fotones), ambas imágenes tienen una calidad de imagen similar, pero el detector SilVIR informa específicamente el recuento de fotones.

_{Figura 14. Tanto los detectores SilVIR como los PMT GaAsP pueden adquirir una imagen clara a partir de la muestra con una relación entre señal-ruido equivalente. La Figura 14(a) fue adquirida con el detector SilVIR, mientras que la 14(b) con el detector PMT a 550 V. La misma muestra fue excitada usando la misma potencia del láser. La intensidad máxima de fluorescencia es de casi 128 fotones/2 µs.}

_{Escáner: escáner galvanométrico, 2 µs/píxel
Excitación: láser de 488 nm
Emisión: de 500 a 540 nm
Filamentos de actina (BODIPY FL) de células BPAE}

Sin embargo, no ocurre lo mismo con la fluorescencia débil. La Figura 15 muestra la misma muestra con una fluorescencia débil (cerca de 12 fotones) capturada con los dos detectores. Aquí, puede verse que las imágenes capturadas con el detector SilVIR presentan menos ruido que las capturadas con el PMT GaAsP. Además, el histograma de peine traza la intensidad de la imagen SilVIR, lo que indica que se detectó con precisión la cantidad de fotones en cada píxel. En cambio, el histograma de intensidad de la imagen brindada por el detector PMT GaAsP muestra que dicha intensidad es aleatoria, lo que reduce la posibilidad de una cuantificación de fotones. Además, es necesario ajustar la tensión a un valor elevado según la intensidad de la fluorescencia que debe detectarse con el detector PMT GaAsP, lo que no es el caso con el detector SilVIR.

_{Figura 15. Esta figura muestra un ejemplo de una fluorescencia bastante tenue (15a), capturada con un detector SilVIR y un detector PMT GaAsP (15b) a 700 V. La misma muestra fue excitada usando la misma potencia del láser. La intensidad máxima de fluorescencia es de casi 12 fotones/2 µs. El histograma de peine asociado a la intensidad de la imagen, capturada con el detector SilVIR, indica el número de fotones que fueron detectados con precisión. Se observó más ruido en el fondo de la imagen adquirida con el detector PMT}

_{Escáner: escáner galvanométrico, 2 µs/píxel
Excitación: láser de 488 nm
Emisión: de 500 a 540 nm
Microtúbulos (Alexa Fluor 488) de células PtK2}

Imágenes de óptima relación entre señal-ruido obtenidas por los escáneres resonantes dotados de un detector SilVIR

El detector SilVIR es idóneo para obtener imágenes de fluorescencia de baja intensidad. En particular, al adquirir imágenes mediante un escáner resonante, es difícil obtener imágenes con una óptima relación entre señal-ruido, dado que el número de fotones detectados es muy pequeño debido a la duración muy corta de los píxeles. El detector SilVIR supera este problema. La Figura 16 es una imagen capturada con un escáner resonante de 1024 × 1024 píxeles. Imágenes, dotadas de un número diferente de promedio, se exponen de forma alineada. No importa si el número de fotones detectados presenta varios niveles fotónicos, incluso de esta forma es posible obtener una imagen de buena calidad por medio del escáner resonante; y, el pequeño número de promedios (o acumulaciones) permite el procesamiento de la imagen del escáner resonante para que brinde una calidad equivalente a la imagen del escáner galvanométrico. Esto también aumenta la eficiencia a nivel de la adquisición de las imágenes.

_{Figura 16. Imágenes adquiridas mediante el detector SilVIR en un escáner resonante de 1K. La Figura 16(a) no muestra ningún promedio de 130 ms/fotograma; la 16(b) muestra dos veces un promedio de 262 ms/fotograma, y la 16(c) muestra cuatro veces un promedio de 522 ms/fotograma. Puesto que el detector SilVIR puede adquirir imágenes con una óptima relación entre señal-ruido a través de un escáner resonante, el pequeño número del promedio es suficiente para obtener una imagen de alta calidad. Esto también optimiza la eficiencia a nivel de la adquisición de imágenes.}

_{Escáner resonante: 1024 × 1024 píxeles unidireccionales, duración del píxel: 0,033 µs
Intensidad máxima de fluorescencia: cerca de 20 fotones.}

Adquiera imágenes con aplicación mosaico de manera eficiente gracias el detector SilVIR

Para adquirir una imagen de alta resolución y de área amplia, a menudo se usa la aplicación mosaico para las imágenes. Este proceso es lento si se emplea un escáner galvanómetro, pero el uso del detector SilVIR combinado con un escáner resonante hace que este proceso sea mucho más eficiente. En la Figura 17, las imágenes de cuatro canales y 1K × 1K píxeles se adquirieron a partir de ocho cortes Z en un campo de mosaicos de 5 × 5. Al usar un escáner galvanométrico, la captura de la imagen requirió más de 30 minutos a diferencia del escáner resonante que tan sólo requirió menos de 6 minutos.

_{Figura 17. Adquisición eficiente de imágenes con el detector SilVIR. Se adquirió una proyección de máxima intensidad a partir de imágenes unidas provenientes de seccionamientos en Z con un escáner resonante. Gracias a la óptima relación señal-ruido del detector SilVIR, es posible adquirir una gran cantidad de imágenes de manera eficiente.}

Adquisición de imágenes de alto rango dinámico con el detector SilVIR

El rango dinámico se ve limitado frente al procesamiento de imágenes con detectores PMT convencionales; si la muestra presenta una mezcla de objetos oscuros y brillantes, debe priorizarse uno de ellos. Por ejemplo, en la Figura 18, al adquirir una imagen de neuronas, la saturación de intensidad en el cuerpo celular fue inevitable para adquirir imágenes claras de la estructura de la fibra neuronal con una fluorescencia débil. En cambio, el detector SilVIR puede adquirir áreas brillantes y oscuras sin saturación gracias a su rango dinámico de 16 bits.

_{Figura 18. Procesamiento de imágenes de alto rango dinámico con el detector SilVIR. La Figura 18(a) muestra una imagen convencional donde algunos cuerpos celulares más brillantes alcanzan fácilmente la saturación, mientras que la Figura 18(b) muestra una imagen capturada con el detector SilVIR donde tanto el cuerpo celular como las fibras neuronales se encuentran en el rango de detección. Las fibras neuronales tenues mejoraron ajustando la pantalla gamma.}

Procesamiento multicromático con el detector SilVIR

Sacar provecho de la alta sensibilidad del detector SilVIR y de la relación entre S/N a partir del procesamiento de imágenes simultáneo de seis colores, desde la región visible hasta la del infrarrojo cercano, es posible a la vez que se evitan los efectos parásitos (Figura 16). Las tinciones fluorescentes excitadas a 730 nm difícilmente pueden obtenerse mediante un detector PMT GaAsP, pero el detector SilVIR puede adquirir imágenes con una alta relación entre señal-ruido. El microscopio confocal FV4000 puede dotarse de un detector de hasta seis canales, lo que permite ejecutar un procesamiento de imágenes simultáneas de seis colores, con una resolución espectral de precisión nanométrica que va de 400 a 900 nm.

_{Figura 19. Imagen simultánea de seis colores capturada con el detector SilVIR y la tecnología TruSpectral. Es posible ejecutar un procesamiento de imágenes multicromáticas simultáneas que van desde la región visible hasta la del infrarrojo cercano.}
 

6. Conclusión

En comparación con los detectores convencionales, el detector SilVIR ofrece muchas ventajas, entre ellas:

• Procesamiento de imágenes multicromáticas con alta sensibilidad y óptima relación entre señal-ruido desde el rango de longitud de onda visible hasta el infrarrojo cercano.
• Alta resolución en la detección fotónica (recuento de fotones con alta velocidad y alto rango dinámico).
• Alta reproducibilidad experimental basada en la cuantificación del brillo de la imagen sin degradar la sensibilidad.
• Funcionamiento sencillo que evita la necesidad de ajustar la ganancia como en el caso de un detector PMT.

Estos beneficios facilitan la obtención de imágenes de alta velocidad y de alta resolución con una óptima relación entre señal-ruido, a la vez que se reduce la fototoxicidad. Además, como el brillo de la imagen puede cuantificar como el número de fotones, es más fácil compartir y reproducir las condiciones del procesamiento de imágenes.

Además, los sensores SiPM presentan un gran potencial de desarrollo tecnológico para el futuro. Por ejemplo, el parámetro FF, que determina la detección fotónica (PDE), puede mejorarse en gran medida si el conjunto de microlentes en desarrollo puede implementarse satisfactoriamente con los próximos sensores de matriz de fotodiodos de avalancha por recuento de fotón individual (SPAD) y las técnicas de reparto por anillos de guarda (guard-ring-sharing) [6]. Si la PDE puede aumentar, será más fácil equilibrar las complejas compensaciones entre la relación señal-ruido, el rango dinámico, la velocidad y la cantidad de píxeles.

Creemos que el detector SilVIR puede devenir el estándar para los microscopios de escaneo láser de última generación dado su rendimiento ante los desafíos que debían superar los detectores convencionales y su potencial para innovar en el desarrollo del futuro.