Método de seccionamiento óptico SILA para obtener imágenes nítidas de muestras gruesas

Los escáneres de portaobjetos han ganado popularidad entre los investigadores por su estructura compacta y su gran diversidad de utilización. Una de sus potentes aplicaciones es con la microscopía de fluorescencia de campo amplio (widefield, WF) para detectar fluorescencia en muestras delgadas. En el caso de aplicaciones con muestras gruesas, una potente solución para ejecutar el procesamiento de imágenes es la adquisición por iluminación granular «speckle» o SILA. Al combinarse con nuestro escáner de portaobjetos de investigación SLIDEVIEW™ VS200, el procesamiento de imágenes SILA proporciona un seccionamiento óptico rápido para imágenes de portaobjetos digitales. Este método elimina la luz fuera de enfoque proveniente de las muestras gruesas con el fin de mejorar el contraste en gran medida.

Limitaciones de la microscopía de fluorescencia de campo amplio

La microscopía WF es una técnica de digitalización de imágenes en la que un área relativamente grande de una muestra se ilumina con luz de una longitud de onda específica (excitación). Las moléculas fluorescentemente activas se distribuyen dentro del volumen de la muestra y se unen a áreas específicas mediante el proceso conocido como tinción fluorescente. Estas moléculas absorben la longitud de onda de excitación y posteriormente emiten luz de una longitud de onda más larga, la cual es detectada por una cámara.

La señal emitida, que es recuperada por la cámara, proviene de todas las moléculas alcanzadas por la luz de excitación a través de la muestra, donde la potencia de la luz de excitación es suficientemente alta. Por lo tanto, las finas estructuras teñidas con fluorescencia en el plano focal se ven borrosas por la presencia de luz desenfocada. La solución a este problema es la aplicación de métodos de seccionamiento/corte óptico, que producen imágenes nítidas y sin desenfoques.

Introducción a la tecnología SPARQ para un rápido seccionamiento óptico

El procesamiento de imágenes SILA usa la tecnología SPARQ (desarrollada por la empresa Bliq Photonics), que combina un algoritmo HiLo¹ y una unidad de cifrado «speckle» para proporcionar un rápido seccionamiento óptico. Esta tecnología permite eliminar la luz fuera de enfoque a partir de las imágenes de campo amplio, lo que posibilita un rendimiento similar al de la microscopía confocal. ^1-3

Esta tecnología consiste en la adquisición de dos imágenes a partir de la muestra: una con iluminación uniforme y otra con una iluminación espacialmente estructurada introducida por el moteado del láser estocástico en una muestra. Tras adquirir ambas imágenes, éstas se combinan informáticamente para producir una imagen nítida. La transición entre los dos estados del procesamiento de imágenes se ejecuta utilizando la unidad de cifrado «speckle», como se ilustra en la Figura 1.

Figura 1. Adquisición de una imagen con SILA.

1. Iluminación uniforme

La imagen iluminada uniformemente contiene señales provenientes de objetos que están enfocados y fuera de enfoque. El contenido desenfocado aparece borroso y, por lo tanto, contiene sólo componentes de baja frecuencia espacial. Aplicar un filtro de paso alto simple a la imagen uniforme filtraría el contenido desenfocado y dejaría enfocada la imagen uniforme de alta frecuencia. Sin embargo, también tendría el efecto indeseable de suprimir los elementos de baja frecuencia espacial presentes en el plano focal.

Para recuperar el contenido de baja frecuencia de la muestra en el plano focal, se adquiere y procesa una iluminación estructurada de alta frecuencia (producida por los «speckles» [motas/gránulos]). De esta forma es posible recuperar la señal de baja frecuencia y distinguir la señal que se origina únicamente en el plano de interés.

2. Iluminación granular «Speckle»

Los gránulos o, también denominados motas, son fluctuaciones aleatorias que se originan a partir de reflexiones difusas o eventos de dispersión sobre irregularidades medias, características de fuentes de luz coherentes como los láseres. La interferencia de estas reflexiones o eventos de dispersión generan los patrones estocásticos granulares proyectados en la muestra.⁴

La iluminación granular aplica una modulación espacial de alta frecuencia a la muestra. Una característica importante de este tipo de iluminación es que el contraste de modulación se limita al plano focal del sistema de microscopía. Por ende, medir el contraste local de la modulación de la imagen permite determinar en qué medida el objeto está enfocado o presenta contribuciones enfocadas.

3. Combinación de ambas imágenes

Mediante un filtro de paso alto, las altas frecuencias del plano focal son extraídas desde la imagen de iluminación uniforme. A partir de la imagen de iluminación granular «speckle», la medición del contraste local determina hasta qué punto el objeto está bajo enfoque o contiene contribuciones en enfoque. Al aplicar un filtro de paso bajo sobre la imagen de medición de contraste local, se obtiene la señal enfocada de baja frecuencia.

Como tal, al ajustar adecuadamente los filtros de paso alto y bajo, el contenido enfocado de baja frecuencia —obtenido a partir de la imagen de iluminación granular— puede complementar el contenido enfocado de alta frecuencia obtenido a partir de la imagen de iluminación uniforme. La combinación del contenido de la imagen de alta y baja frecuencia da como resultado una imagen enfocada de resolución completa que contiene todos los componentes de frecuencia dentro del ancho de banda de frecuencia del sistema de imágenes (Figura 2).^1-3

Figura 2. Diagrama de procesamiento SILA.

Es interesante observar que también es posible ajustar el grado del seccionamiento óptico al cambiar simplemente una configuración llamada «parámetro de espesor de seccionamiento» (ST). Aumentar el valor del parámetro ST es análogo a aumentar el tamaño del estenopo (diagrama) de un microscopio confocal.

Al aumentar el valor ST se obtienen contribuciones a partir de un rango más amplio de contraste granular «speckle» (es decir, un mayor volumen de señal) durante el procesamiento de imágenes SILA. La intensidad general aumenta y la relación señal-ruido (SNR) cambia consecuentemente. Sin embargo, al igual que en la analogía estenopeica, en la que la ganancia de la señal se debe a una obtención fuera del plano focal, el aumento del valor ST dará como resultado una imagen SILA menos seccionada ópticamente.

Ejemplo de un resultado experimental con el método de seccionamiento óptico SILA

Seccionamiento transversal del criostato de un hígado de ratón en 16 µm{(portaobjeto#3 preparado con FluoCells, F24630), iluminado a través de los procesamientos de imágenes de campo amplio (WF) y SILA. El valor del parámetro ST se configuró a 2 (escáner VS200; objetivo UPLSAPO40XS; A. N. de 1,25, D. T. de 300 µm, cámara ORCA-Fusion de Hamamatsu). Este valor de parámetro fue elegido como el óptimo para la iluminación según el espesor de la muestra. Un parámetro ST demasiado bajo puede provocar granulosidad en la imagen SILA generada debido a la naturaleza estocástica inherente de los gránulos (speckles).⁵

La longitud de onda de excitación utilizada para la adquisición fue de 488 nm. Se usó también un espejo dicroico multibanda (para DAPI, FITC, Cy3 y Cy5) y un filtro de emisión único para el isotiocianato de fluoresceína (FITC). El tiempo de exposición de la cámara se determinó a 60 ms. La Figura 3a muestra la imagen procesada con campo amplio (WF), y la Figura 3b muestra la misma región escaneada mediante el procesamiento de imágenes SILA con el valor ST determinado a 2 en la misma posición Z. Se observó un contraste mejorado en toda la muestra. Al centrarnos en las áreas de 1 a 4, las imágenes SILA muestran visiblemente más detalles que el método WF.

Figura 3. (a) Imagen de campo amplio (WF) de un riñón de ratón con la tinción de aglutinina de germen de trigo Alexa Fluor 488 (W-11261). Los rectángulos blancos marcan las cuatro regiones de interés (ROI de 1 a 4) de las estructuras comparadas. (b) Imagen SILA seccionada ópticamente mediante el valor 2 del parámetro ST en función de 6,803 µm. Los recuadros muestran las regiones de interés ampliadas (de la 1.º a la 4.º) con canales fusionados para los procesamientos de imágenes de WF y SILA (centro superior: WF; centro inferior: SILA). Se puede apreciar que el contraste de la imagen con el procesamiento de imágenes SILA ha mejorado mucho. En comparación, algunas estructuras apenas se notan en la imagen de WF. Tenga en cuenta que las áreas de interés (ROI) detalladas se muestran a través de diferentes escalas de intensidad para demostrar las estructuras detalladas resueltas. 269

Diseño óptico del sistema de procesamiento de imágenes SILA

El dispositivo de seccionamiento óptico SILA está construido sobre un escáner de portaobjetos de campo amplio (nuestro sistema VS200), cuya fuente de luz fluorescente normal ha sido reemplazada con una fuente de luz coherente producida por diodos láser acoplados a una fibra monomodo. La fuente láser, acoplada a la fibra monomodo, se proyecta a través de la unidad de cifrado «speckle», generando gránulos en el plano de la muestra para la iluminación estructurada, y los elimina para una iluminación uniforme. Mediante un control preciso de la iluminación láser y la unidad de cifrado, las imágenes individuales SILA se calculan y se unen, formando la imagen de portaobjetos completo seccionada ópticamente.

Figura 4. Diagrama de la configuración del procesamiento de imágenes SILA; contiene una fuente de luz coherente, una unidad de cifrado «speckle» que produce una iluminación uniforme o granulada, una trayectoria óptica que lleva un objetivo que introduce la luz en la muestra y recoge la luz emitida, y una cámara como detector de luz.

Mediciones de calidad

1. Tiempo de escaneo

El tiempo de escaneo del procesamiento de imágenes SILA ha sido probado en áreas pequeñas de 5 mm × 5 mm. Si bien se adquirió un par de imágenes a partir de cada campo visual de la cámara, el tiempo de adquisición de las imágenes SILA no se duplica en comparación con las imágenes WF. Por ejemplo, se observó un aumento de sólo el 53 % en el tiempo de adquisición del objetivo de aire de 40X. En la Tabla 1, se ilustran otros resultados.

Tabla 1. Valores de tiempo de escaneo registrados con respecto a las imágenes adquiridas por WF y SILA a través de una cámara ORCA-Fusion (Hamamatsu Photonics) con cuatro canales (DAPI, FITC, CY3, CY5) y una exposición de 50 ms para un área de escaneo de 5 mm × 5 mm. El aumento en el tiempo de escaneo se calcula en función de cada magnificación. 275

2. Resolución

La resolución óptica de las imágenes SILA es la misma que la de las imágenes WF. La resolución teórica asociada a los objetivos con una alta apertura numérica ha sido simulada en torno a 0,2 µm en dirección lateral y 0,45 µm en dirección axial. Los valores experimentales de la función de extensión de puntos (PSF) se obtuvieron a través de un objetivo de inmersión en aceite (UPLXAPO100XO, A. N. de 1,45) a partir de una muestra que contenía microesferas fluorescentes (microesferas TetraSpeck, de 0,1 µm, azul/verde/naranja/rojo oscuro fluorescente) usando una longitud de onda de emisión de 520 nm. La anchura de banda a media altura (FWHM) para imágenes obtenidas por campo amplio (WF) es de 0,22 µm en la dirección lateral y 0,47 µm en la dirección axial. Se confirma que los valores calculados teóricamente coinciden con aquellos PSF medidos experimentalmente a partir de microesferas muy pequeñas.

3. Capacidad de seccionamiento óptico

La fuerza del procesamiento de imágenes SILA reside en la capacidad de ejecutar el seccionamiento óptico. En las Figuras de 5a a 5d podemos ver un ejemplo de una subregión de los riñones de ratón de la Figura 3 bajo diferentes parámetros ST, con las correspondientes vistas ortogonales en las Figuras de 5e a 5h. La muestra completa se adquirió mediante un apilamiento en Z de 39 imágenes con un espaciado en Z, determinado a 0,34 µm. Con la disminución del valor ST, es posible incrementar el contraste entre las estructuras y el fondo, tal y como se aprecia en la Figura 5i. Por ende, es más fácil identificar detalladas estructuras.

Para demostrar lo mencionado, se trazó un perfil lineal en la dirección X de una sección Z en el mismo punto para cada parámetro ST y para la imagen WF. Al comparar los perfiles lineales normalizados se aprecia claramente que los detalles son más evidentes con el procesamiento de imágenes SILA a diferencia del sistema de campo amplio (WF) común. Los picos de intensidad correspondientes a las estructuras son superiores en comparación con la intensidad del fondo y más escasos con el valor decreciente del parámetro ST.

Figura 5. Optimización del seccionamiento óptico usando la iluminación SILA en comparación con la iluminación de campo amplio (WF). (a) Iluminación de WF, e (b) Iluminación SILA con el parámetro ST10, (c) con el parámetro ST5 y (d) SILA con el parámetro ST2. Cada imagen lleva una flecha que indica la medida del perfil lineal y la posición del plano visual ortogonal en la dirección X [de (e) a (h)]. Cada imagen SILA con los diferentes parámetros ST y cada imagen de WF se adquieren por apilamiento en Z, como la vista ortogonal en la dirección X. Las líneas azules indican el mismo plano Z que se muestra en las figuras de (a) a (d). La barra de escala horizontal corresponde a 20 µm y la barra de escala vertical corresponde a 5 µm y se aplica a todas las subfiguras. (i) Los perfiles lineales registrados se indican en las figuras de (a) a (b) y se comparan con el WF en azul, el SILA determinado a ST10 en naranja, SILA determinado a ST5 en gris y SILA determinado a ST2 en amarillo. Todos los gráficos están normalizados a 1. Se observa una mejora del contraste al disminuir el parámetro ST.

4. Profundidad de campo

El método de seccionamiento óptico SILA logra la obtención de imágenes a partir de muestras que superan un espesor de varios cientos de micras. En particular, cuando las muestras son aclaradas, la profundidad de penetración de las imágenes SILA solo se ve limitada por la distancia de trabajo del objetivo. Si las muestras no son aclaradas, las estructuras de la muestra pueden dispersar la luz, lo que dificulta el alcance a las capas celulares más profundas.⁶

Figura 6. a) Proyección de máxima intensidad (MPI de 188 planos, con espaciado Z = 2,36 μm) de una imagen SILA (ST = 2) proveniente del intestino de un ratón que muestra vasos sanguíneos (cian) y vasos linfáticos (magenta). b) El cuadrado de contorno punteado de blanco indica la primera área de interés (ROI 1) ampliada desde (a), donde la línea azul indica la posición de la vista ortogonal XZ y la línea roja indica la posición de la vista ortogonal YZ. c) El rectángulo azul muestra la vista ortogonal en la dirección YZ, y d) el rectángulo rojo muestra la vista ortogonal en la dirección XZ. Las líneas amarillas indican el mismo plano Z que se muestra en la figura (b). Sección de intestino de ratón con FluoTissue de 450 μm [Laboratorio Sun Jin] procesada usando RapiClear 1.52.

5. Repetibilidad

El procesamiento de imágenes SILA permite calcular una imagen de seccionamiento óptico a partir de una imagen uniforme y granulada/moteada. En el mejor de los casos, sería que la estructura granular se filtrara por completo y no fuera observable en la imagen final obtenida por el procesamiento SILA. Sin embargo, éste no es el caso. La iluminación granular «speckle» define inherentemente una ligera variación en la intensidad de la señal. Por ejemplo, en una imagen, un gránulo/mota «speckle» puede iluminar un detalle de la muestra, mientras que en otra puede que no. Este fenómeno explica las variaciones de intensidad residual observadas en la imagen final. Esta variación es estocástica por definición, y es una fuerza (sección óptica y profundidad de penetración) así como una limitación en esta técnica (variación de intensidad en la señal).

Para investigar la variación de la intensidad de la señal, registramos una secuencia de 10 escaneos (ver Figura 7) en función de cuatro parámetros ST distintos (ver Figura 8a). En cada muestra, se calculó el coeficiente de variación (CV) sobre 90 áreas de interés (ROI) —elegidas arbitrariamente con estructuras— para cuantificar la variación de intensidad a lo largo de la secuencia de escaneo:

En ese sentido, el valor I_mean,ROI es la intensidad de fluorescencia media de un área de interés (ROI) para un solo escaneo. Mientras que los valores stdstack y mediastack son respectivamente la desviación estándar y los valores medios de I_mean,ROI, en toda la secuencia de escaneo conformada por 10 escaneos. La Figura 7c muestra un ejemplo de 25 ROI y sus perfiles de intensidad de fluorescencia media a través de esos 10 escaneos.

El coeficiente de variación (CV), que se calculó a partir de tres diferentes muestras con áreas que contienen estructuras, disminuye en función del valor ST (Figura 8b); cuando se determina un valor superior al parámetro de seccionamiento, la fuerza del filtrado espacial en la imagen granulada «speckle» es más débil, lo que resulta en variaciones de intensidad más pequeñas en las imágenes SILA. El coeficiente de variación de las imágenes SILA, medidas a partir de tres estructuras diferentes a través de 90 áreas de interés (ROI) detectadas, es en promedio 3,7 ± 1,4 %. A modo de comparación, la variación en la intensidad de la señal con el modo WF es de aproximadamente el 0,3% y es inherente al sistema.

Figura 7. a) Ejemplo de una muestra de cerebro de ratón (teñida con Cy3 y dotada de un espesor de 100 µm) adquirida por el procesamiento de imágenes SILA con un parámetro ST determinado a 10 y una magnificación de 40X. En cada área se han ejecutado diez escaneos en función del mismo plano focal y área. b) Las áreas de interés (ROI) cian muestran estructuras elegidas para nuestras mediciones de intensidad de fluorescencia media (Imean,ROI). Las barras de escala corresponden a 50 µm. c) Perfiles de intensidad de fluorescencia media de las ROI elegidas que se han mostrado previamente. Cada línea corresponde a una ROI. Considere que, para llegar a una mejor interpretación, sólo se muestra una pequeña sección de la imagen que agrupa 25 ROI.

Comparación con otras técnicas de seccionamiento óptico

En las figuras a continuación, se compara el procesamiento de imágenes SILA con la microscopía de campo amplio normal, algoritmos de desenfoque, deconvolución y microscopía de escaneo/barrido confocal láser. El procesamiento de imágenes SILA ofrece una vasta optimización a nivel del seccionamiento óptico y el contraste si se le compara con el procesamiento regular de campo amplio al usar un algoritmo de desenfoque. En comparación con la deconvolución, la tecnología SILA mejora la calidad de la imagen. Además, sus capacidades de seccionamiento óptico sobre la marcha reducen el tiempo de procesamiento prolongado que frecuentemente se relaciona con la captura de imágenes de portaobjetos completos de gran tamaño.

En comparación con la microscopía confocal, la tecnología SILA brinda una calidad de imagen casi similar. Como bien se conoce, la microscopía de campo amplio padece de la inexistencia de fluorescencia de fondo. Tanto la microscopía confocal como la SILA producen imágenes seccionadas ópticamente con un contraste superior y revelan finos detalles en la organización celular, a pesar de la naturaleza dispersa de la muestra. Se requeriría una comparación adicional entre el procesamiento de imágenes SILA y la microscopía confocal para comparar los detalles de la imagen y las variaciones espaciales en la distribución de intensidad. Sin embargo, el rendimiento de la tecnología SILA es suficiente para estudios de evaluación cualitativa y colocalización. El procesamiento de imágenes SILA puede servir como una herramienta de escaneo rápido para examinar grandes cantidades de muestras. Aquellas muestras con estructuras de interés pueden tratarse con el microscopio confocal para obtener imágenes cuantitativas.

Figura 9. Imagen de un Platelminto Planaria, Schmidtea Mediterranea (objetivo de 20X). Se comparan tres técnicas: a) imagen con WF, b) imagen con WF usando un algoritmo de desenfoque e c) imagen SILA con un parámetro ST de 5. Azul: DAPI; Verde: Células internas del intestino; Rojo: Células externas del intestino. Muestras proporcionadas por Amrutha Palavalli, Departamento de Dinámica y Regeneración de Tejidos, Instituto Max Planck de Ciencias Multidisciplinarias, Goettingen, Alemania. La barra de escala corresponde a 500 µm y se aplica a todas las subfiguras.

Figura 10. Imagen de un cerebro de ratón grueso teñido con MAP2 (objetivo de 20X). Se comparan tres técnicas: a) imagen con WF mediante la proyección de imagen focal extendida (EFI), b) imagen con WF mediante proyección EFI y deconvolución aplicada, e c) imagen con SILA mediante proyección EFI y un parámetro ST de 2. Las barras de escala corresponden a 50 µm.

Figura 11. Imagen de una muestra de cerebro de ratón marcada con proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y que muestra neuronas (objetivo de 20X). Se comparan tres técnicas: a) imagen confocal adquirida usando un microscopio FLUOVIEW™, b) misma imagen confocal con la deconvolución adicional, e c) imagen SILA con un parámetro ST de 2. La barra de escala corresponde a 50 µm y se aplica a todas las subfiguras.

Conclusión

El dispositivo de seccionamiento óptico SILA para el escáner VS200 nos permite obtener imágenes con contraste mejorado en el caso de muestras de gran espesor. En comparación con la microscopía de campo amplio (WF), el tiempo de escaneo aumenta en promedio un 53 % cuando se emplea el objetivo de aire de 40X. La profundidad óptica que puede alcanzarse se ve limitada únicamente por la distancia de trabajo de nuestra configuración óptica, tal y como se ha podido confirmar al escanear muestras muy gruesas con un espesor de hasta 500 μm. La resolución axial usando SILA es la misma que la de las imágenes por WF, pero el seccionamiento óptico mejora de forma exponencial y puede controlarse mediante el parámetro de espesor de seccionamiento.

Si se determina un valor superior en el parámetro ST, la fuerza del filtrado espacial en la imagen granular/moteada (speckle) será más débil; esto da como resultado variaciones de intensidad más pequeñas en las imágenes obtenidas por SILA, lo que en nuestros ejemplos se midió como un promedio de 3,7 ± 1,4 %. La variación de intensidad superior provocada por el parámetro ST de 1 puede limitarse aumentando el parámetro ST. Debe tenerse en cuenta este ajuste cuando se requiere un análisis cuantitativo de las intensidades de fluorescencia.

El sistema nos permite obtener rápidamente imágenes comparables a aquellas con microscopía confocal o deconvolución aplicada. Creemos que esta tecnología puede aplicarse al escaneo rápido de portaobjetos dotados de muestras gruesas, y que es beneficiosa para obtener imágenes nítidas y de alto contraste con un enfoque nítido en los detalles.

Referencias

1. Lim, D., Ford, T., Chu, K.K., y Mertz, J. 2011. «Optically Sectioned In Vivo Imaging with Speckle Illumination HiLo Microscopy» Periódico Biomedical Optics. 16, 016014.
2. Lim, D., Chu, K.K., y Mertz, J. 2008. «Widefield Fluorescence Sectioning with Hybrid Speckle and Uniform-Illumination Microscopy» Optical Letters. 33, 1819–1821.
3. Mertz, J. y Kim, J. 2010. «Scanning Light-Sheet Microscopy in the Whole Mouse Brain with HiLo Background Rejection.» J. Biomed. Opt. 15, 016027.
4. 4. Goodman, J. W. 2007. «Speckle Phenomena in Optics: Theory and Applications» Roberts and Company Publishers.
5. Schniete, J., Franssen, A., Dempster, J. et al. 2018. «Fast Optical Sectioning for Widefield Fluorescence Mesoscopy with the Mesolens based on HiLo Microscopy.» Sci Rep, 8, 16259.
6. Richardson, D. S. and Lichtman, J. W. 2015. «Clarifying Tissue Clearing» Cell. 162.2: 246–257.

Autores

Anna Zelená, especialista de aplicaciones, Evident Technology Center Europe
Wei Juan Wong, administrado de producto, Evident Technology Center Europe
Gabriel Maranon, responsable experto de producto, Bliq Photonics
Alicja Gąsecka, director de I+D y producción, Bliq Photonics
Mariêve Picard, director de ventas y marketing, Bliq Photonics
Jeck Borne, ingeniero de sistemas, Bliq Photonics

Agradecemos a todo el equipo VS200 del Evident Technology Center Europe.