Fiable procesamiento de imágenes cuantitativo con fluorescencia confocal usando el Monitor de rendimiento microscópico

Introducción

Si bien el procesamiento de imágenes de fluorescencia con microscopía óptica se aplica principalmente a la observación cualitativa, también y cada vez más se le utiliza en el análisis cuantitativo. Por tanto, se recomienda un mantenimiento regular de su sistema, ya que la potencia de la fuente de luz puede fluctuar, por ejemplo, debido a cambios en la temperatura ambiente, lo que resulta en una calidad de imagen deficiente. Asimismo, la potencia láser del sistema también puede variar debido a una ligera falta de alineación a nivel de la óptica desde la fuente láser hasta el estativo del microscopio debido a la expansión térmica del sistema.

Los microscopios confocales son instrumentos complejos y tanto su mantenimiento como la evaluación de su rendimiento requieren el conocimiento de un técnico capacitado. El mantenimiento regular de un microscopio es importante para la reproducibilidad experimental y la calidad de la investigación, y este pormenor ha sido y sigue siendo debatido activamente.^1,2,3,4 La Organización Internacional de Normalización (ISO) también se ha pronunciado sobre el asunto, publicando la norma ISO21073 2019, que especifica el rendimiento de imagen de los microscopios confocales de escaneo láser.⁵

En Evident somos conscientes de la importancia de este tema y nos esforzamos por abordarlo. Cuando se lanzó el microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW™ FV4000 en el año 2023, decidimos respaldarlo con un Monitor de rendimiento microscópico que ayudaría a los gerentes y usuarios de laboratorio a seguir tres parámetros de rendimiento clave susceptibles a influir en las imágenes cuantitativas de fluorescencia confocal y a tener un impacto en la calidad de la imagen.

En este documento técnico, analizamos esos parámetros de rendimiento clave y cómo el Monitor de rendimiento microscópico favorece imágenes cuantitativas de mayor calidad. También exponemos los principios y criterios necesarios para medir cada característica de rendimiento, así como las ventajas que ofrece el Monitor de rendimiento a los centros de laboratorio y otros que desean maximizar sus imágenes cuantitativas de fluorescencia.
 

Factores de rendimiento para controlar asociados al procesamiento de imágenes de fluorescencia cuantitativo

En 2022, O. Faklaris et al. recomendaron siete métricas de rendimiento microscópico que deben verificarse periódicamente, así como pautas para medirlas.⁶Estas siete métricas de rendimiento microscópico son: estabilidad de la potencia de la irradiación, rendimiento de la digitalización de la imagen, planitud de la iluminación de campo, aberración cromática, deriva de la platina, repetibilidad de la posición de la platina y ruido de fondo del detector.

Sin embargo, el problema es que es difícil medir estas características de rendimiento sin un nivel de experiencia en microscopía óptica. Como la obtención de experiencia en este ámbito no es tarea fácil, el mantenimiento regular del microscopio para garantizar que estas siete métricas permanezcan dentro de la tolerancia se torna espinoso, especialmente para los gerentes de centros de laboratorio que son responsables de múltiples sistemas microscópicos.

Evident, como primer paso en su plan de ayuda, desarrolló una solución que permite a los usuarios medir fácilmente las señales de fluorescencia de forma cuantitativa. Esto se debe a que las fluctuaciones en las señales de fluorescencia son difíciles de determinar en función de la apariencia de la imagen; por tanto, hay poca probabilidad de que estos problemas sean notados por los investigadores, a diferencia de algo más fácil de notar como la aberración cromática durante las observaciones de colocalización o la deriva de la platina durante las imágenes en intervalo. Uno de los objetivos del Monitor de rendimiento microscópico es permitir a los investigadores detectar variaciones en el rendimiento desde el inicio del proceso en lugar de haberlo cuando el experimento ha completado la adquisición de las imágenes, lo que potencialmente puede conducir a resultados incorrectos y la repetición del trabajo.

A partir de las siete características mencionadas anteriormente, el brillo de un microscopio de fluorescencia precisa en gran medida de tres: estabilidad de la potencia de la irradiación, rendimiento de imagen y sensibilidad de detección.
Esto se debe a que el brillo de la fluorescencia depende de la intensidad de la luz que se irradia en la muestra, y de qué tan bien pueden detectarse las señales fluorescentes.

En un microscopio de fluorescencia, la intensidad de la luz irradiada hacia la muestra depende de la potencia del láser y del área irradiada. El área irradiada se determina por el rendimiento de imagen, que es una medida de cuán exacto puede ser el instrumento óptico al enfocar el flujo de luz desde una fuente de luz a un solo punto. En otras palabras, tanto el enfoque del rayo láser como la intensidad de la luz que irradia la muestra varían junto con el rendimiento de la imagen.

En lo que concierne a la calidad de detección de las señales fluorescentes, esto depende de la sensibilidad de detección de todo el sistema. Por lo tanto, monitorizar el cambio de la potencia del láser, el rendimiento del procesamiento de imágenes y la sensibilidad de detección es importante para obtener imágenes de fluorescencia cuantitativas coherentes y de alta calidad.

Es importante monitorizar la potencia del láser, ya que al ser irradiada a través de la lente del objetivo puede fluctuar debido a cambios térmicos ambientales u otros factores. El monitor del rendimiento microscópico mide la potencia del láser precisamente tras ingresar en el sistema FV4000 desde la salida de fibra; esto permite que el sistema determine si la potencia ha cambiado con respecto al momento en que se instaló el microscopio. Al ajustar automáticamente la potencia de salida del láser, el sistema puede corregir las fluctuaciones, lo que le permite lograr un valor constante a lo largo del tiempo.

Se requiere monitorizar la sensibilidad de la detección para comprender cuantitativamente cualquier descenso de eficiencia a nivel de la detección, debido al deterioro de la óptica o al desajuste del eje óptico del estenopo desde que el microscopio fue instalado. La posición central del estenopo es especialmente importante para los microscopios confocales de escaneo láser y puede desplazarse si la temperatura ambiente cambia significativamente debido, por ejemplo, a cambios estacionales. Si el microscopio se encuentra en un lugar donde la temperatura se mantiene rigurosamente controlada y constante, puede que no sea necesario monitorizar la sensibilidad de detección; sin embargo, no todos los microscopios confocales de escaneo láser se instalan en este tipo de entorno altamente estable. Por otra parte y aunque poco frecuente, el polvo y las rayaduras en la superficie de la lente también pueden reducir la transmisión de luz. Sin embargo, dado que este cambio es gradual, la degradación lenta del rendimiento puede ser difícil de notar.

Las variaciones en el rendimiento del procesamiento de imágenes se deben principalmente a rayaduras en la superficie de la lente del objetivo, suciedad, uso de aceite de inmersión incorrecto o ajuste incorrecto del collar de corrección. Sin un conocimiento sólido en microscopía, es difícil detectar la mayoría de estos problemas de rendimiento a nivel del procesamiento de imágenes. En algunos casos, se han encontrado problemas de rendimiento causados hasta por la caída de un objetivo: el administrador del centro de laboratorio no estaba al tanto del problema, ya que la caída nunca fue reportada.

Si bien los problemas de rendimiento previamente mencionados a nivel del procesamiento de imágenes están relacionados con la lente del objetivo, otros factores, como los espejos y las lentes mal alineadas con el eje óptico debido a fluctuaciones térmicas, plantean frecuentes desafíos al rendimiento.
 

Funcionamiento del Monitor de rendimiento microscópico

El Monitor de rendimiento microscópico mide de forma independiente la potencia del láser, la sensibilidad de detección y el rendimiento del procesamiento de imágenes. La forma en que este sistema mide cada característica se explica a continuación.

Potencia láser

En la Figura 1 se muestra una descripción general del sistema dedicado a la medición de la potencia láser que viene con el Monitor de rendimiento microscópico. Tras iniciar una medición, el sistema ejecuta automáticamente el siguiente flujo.

1) Láser de 405 nm configurado al 100 %; otros láseres configurados al 0 %.

2) El láser se emite.

3) El láser se refleja parcialmente mediante un divisor de haz (BS) ubicado inmediatamente después de la introducción de la fibra en el FV4000.

4) La potencia de entrada del láser se dirige hacia el detector fotográfico (el monitor de la potencia láser, LPM) que se halla dentro del microscopio FV4000.

5) El sistema calcula la potencia de salida del láser al 100 % del valor de salida LPM real.

6) Se ajusta el láser al 0 %; después, se modifica el láser de longitud de onda corta al 100 %.
Se deben repetir los pasos de 2 a 6 para todos los láseres instalados según la secuencia.

_{Figura 1: Esquema del sistema de medición de potencia láser.}

La corrección automática de la potencia de láser se ejecuta a través del valor medido por el LPM. La salida de corriente medida es comparada con aquella registrada en el momento de la instalación del microscopio; la diferencia se calcula como un porcentaje. Los parámetros de control del láser se ajustan en función del porcentaje calculado para mantener la salida del láser constante. Se recomienda a los usuarios que habiliten esta función de monitorización de potencia láser antes de cada adquisición de imágenes con el objetivo de garantizar que la potencia del láser permanezca constante en cada experimento de procesamiento de imágenes.

Con el fin de determinar en qué medida la potencia de láser medida por el monitor de rendimiento microscópico correspondía con la intensidad de luz real emitida en la muestra, se ejecutó un seguimiento de la potencia láser medida por el monitor de rendimiento y la potencia láser emitida por la lente de objetivo durante seis meses. Los resultados se muestran en la Figura 2. La potencia láser emitida por la lente de objetivo se midió utilizando una lente objetivo UPLSAPO10X.

Tal y como se muestra en la Figura 2, existe una alta correlación entre la potencia láser medida por el Monitor de rendimiento microscópico y la potencia láser emitida por la lente de objetivo; se confirmó que la precisión se encontraba dentro del 5 %. Sin embargo, cuando el láser está configurado a bajo, la potencia láser emitida desde el objetivo no es estable si el instrumento no está debidamente precalentado. La Figura 3 muestra los resultados registrados mientras el sistema se calentaba durante un período de dos horas. Los cambios en la potencia láser emitida a partir del objetivo se registraron en seis valores de ajuste del láser: 1 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % y 100 %. En la Figura 3, se muestra que cuanto más bajo es el valor de ajuste del láser, más pronunciado será el efecto de calentamiento. En función de estos datos, se recomienda que los usuarios precalienten su sistema durante un mínimo de 60 minutos y luego utilicen el Monitor de rendimiento microscópico para corregir la potencia de excitación antes de adquirir las imágenes.

_{Figura 2: Resultados de la comparación entre la potencia láser emitida por la lente de objetivo y la potencia láser medida por el Monitor de rendimiento.}

_{Figura 3. Variación en la potencia de salida del láser emitida a partir del objetivo durante el precalentamiento usando diferentes valores de ajuste láser (1 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % y 100 %).}

La monitorización regular de la potencia láser puede detectar baja potencia en el propio láser, así como defectos en el combinador láser y en la fibra. El factor detonante durante un mantenimiento es cuando la potencia de salida desciende por debajo del 50 % a partir de la potencia de salida medida cuando se instaló por primera vez el sistema microscópico. Cuando la potencia láser alcanza este valor de umbral, puede ser insuficiente para algunas aplicaciones, como la observación profunda, aunque la potencia de salida real siempre se corrige para que sea uniforme.

Si los láseres son usados continuamente durante varias horas, el sistema puede generar calor que afecta la temperatura ambiente, lo que conllevaría a la fluctuación de la potencia láser. Por tal motivo, se recomienda que los usuarios controlen el tiempo de uso de los láseres y corrijan la potencia láser cada vez que se adquieran imágenes, ya que es sensible a los cambios de temperatura.

Sensibilidad de detección

En el caso de la sensibilidad de detección se miden dos características: la sensibilidad de cada detector y la posición del estenopo. En la Figura 4 se muestra una descripción general del sistema de medición a nivel de la sensibilidad de cada detector, y la Figura 5 muestra un diagrama de flujo que ilustra el orden en que se adquieren las imágenes por medio de la sensibilidad de detección. Al igual que la medición de la potencia láse, tras iniciar una medición, el sistema ejecuta automáticamente el siguiente flujo.

Sensibilidad de detección

1) Se selecciona el divisor de haz BS10/90 y active tanto el láser de 405 nm como el detector 1 (la trayectoria óptica se ajusta automáticamente para que el láser se refleje en el detector seleccionado).

2) El espejo prismático que se ubica en la torreta de espejos del estativo microscópico refleja la luz láser a la vez que reduce la potencia láser.

3) La luz láser pasa a través del divisor de haz y el estenopo hasta el sistema de detección FV4000.

4) Se calcula la sensibilidad relativa del detector (la mediana de la imagen) al compararla con la sensibilidad del mismo detector medida al momento de la instalación.

5) Se apaga el detector 1, se enciende el detector 2 y se repiten los pasos de 2 a 4.

6) Se repite este proceso para todos los detectores instalados.

Posición del estenopo

7) Se selecciona nuevamente el detector 1 y se repiten diez veces los pasos de 2 a 4 en cada una de las diez posiciones del eje óptico del estenopo (cinco posiciones en cada uno de los ejes X e Y, en los que la superficie del estenopo es el eje XY).

_{Figura 4: Esquema general del sistema de medición de la sensibilidad de detección}

_{Figura 5: Diagrama del flujo de medición de la sensibilidad de detección}

La medición de la sensibilidad de detección implica medir la variación de la sensibilidad a partir de cada detector y posición adecuada con respecto al desplazamiento del eje óptico del estenopo. El descenso de la sensibilidad de detección general del dispositivo puede atribuirse a una alineación incorrecta de las posiciones del eje óptico del estenopo.

Los gráficos superiores izquierdo y central en la Figura 6 muestran la relación entre las posiciones del eje óptico de los 11 estenopos y los valores de salida correspondientes del sistema de detección en las direcciones del eje X y del eje Y. Estos gráficos también muestran curvas de aproximación gaussiana creadas a partir de cinco de los 11 puntos de datos. Si se usa la aproximación gaussiana, la cantidad del desplazamiento puede calcularse con un alto grado de precisión, incluso cuando no es posible obtener datos sobre la posición central del eje óptico del estenopo.

La reducción en la intensidad de la fluorescencia causada por la falta de alineación del eje óptico del estenopo depende del aumento y la apertura numérica (A. N.) de la lente de objetivo. El estenopo se coloca en coordinación con el plano focal del objetivo, y el tamaño del disco Airy en el plano del estenopo se determina a partir de tres factores: la magnificación de la lente de objetivo, la magnificación de la lente de proyección y el tamaño del disco Airy en el plano focal.

El gráfico superior derecho en la Figura 6 muestra la relación entre el grado de desajuste del eje óptico del estenopo y la intensidad de fluorescencia en la muestra celular cuando se utilizan dos tipos de lentes de objetivo. La parte inferior de la Figura 6 muestra tres ejemplos de imágenes de fluorescencia. A través de ellas se muestran células capturadas con un objetivo UPLXAPO20X cuyos ejes ópticos a nivel del estenopo varían respectivamente en –0,5 unidades Airy [AU], 0 AU (estándar) y +0,5 AU. El gráfico superior a la derecha en la Figura 6 se trazó en función de las intensidades de fluorescencia obtenidas a partir de estas imágenes, así como de las imágenes adquiridas en cada cantidad de desplazamientos con los objetivos UPLXAPO20X (A. N. de 0.8) y UPLSAPO100XS (A. N. de 1.35).

Los resultados están asociados a una magnificación de 1X en el caso de la lente de proyección y se muestra que, si hay un desplazamiento del eje óptico del estenopo en 0,32 unidades Airy [AU] (asumiendo un tamaño de disco Airy de 1 para el objetivo UPLXAPO20X), la intensidad de la fluorescencia disminuye de un 10 % en el caso del objetivo UPLXAPO20X y de un 1,1 % en el caso del UPLSAPO100XS. Esto pone en manifiesto que el efecto de la falta de alineamiento del eje óptico del estenopo difiere según la lente de objetivo usada.

_{Figura 6: Valores medidos a partir de la falta de alineamiento del eje óptico en comparación con la sensibilidad de detección (trazo izquierdo superior, trazo central superior). Intensidad de fluorescencia de los objetivos UPLXAPO20X y UPSAPO100XS en función de la falta de alineamiento del eje óptico del estenopo (gráfico superior izquierdo). Imágenes de células adquiridas mediante un objetivo UPLXAPO20X con el eje óptico desviado respectivamente a –0.5 unidades Airy [AU], 0 AU y +0.5 AU.}

Si la sensibilidad de cada detector disminuye a menos del 80 % con respecto al valor que se midió cuando el sistema fue inicialmente instalado, se requiere un mantenimiento. Los aspectos que deben considerarse en cuanto a la posición del estenopo se basan en la tasa de reducción de la intensidad de fluorescencia cuando se usa el objetivo UPLXAPO20X: es decir, el que presenta un mayor efecto. Dado que para los investigadores resulta complejo ajustar la sensibilidad del detector, así como la posición del estenopo, se recomienda que los usuarios contacten con Evident si los resultados se muestran como fallidos («Failed»).

Se recomienda medir la sensibilidad de detección de forma frecuente y, en cada momento, cuando el procesamiento de imágenes cuantitativo es crítico, la sensibilidad de detección cambia mínimamente con los cambios de la temperatura ambiente y el sistema se calienta.

Rendimiento del procesamiento de imágenes

La Figura 7 muestra cómo se debe calcular la función de franja tridimensional (3D LSF, siglas en inglés) mediante observaciones de reflexión tridimensionales de una muestra de grafo con arcos/aristas. El proceso se descompone en los siguientes pasos a partir de la medición hecha en la imagen reflejada hasta la evaluación cuantitativa del rendimiento de procesamiento de imágenes.

1) Se selecciona una lente de objetivo que debe medirse.

2) Se determina una muestra de grafo por arcos/aristas en la platina FV4000.

3) Se enciende el láser 561 nm; se determina el divisor de haz en (BS)10:90, y se habilita un detector.

4) Se determina el estenopo a 2 unidades Airy [AU] para adquirir las imágenes de reflexión confocal 3D a partir de la muestra de grafo por arcos/aristas.

5) Se retienen las respuestas de los arcos/aristas 3D a partir de la imagen 3D (grafo estrella), que consiste en ocho direcciones.

6) Se calcula la LSF por medio de la diferenciación en la respuesta de los arcos/aristas.

7) Se calcula la franja tridimensional, así como los valores de correlación cruzada 2D de la LSF en función del rendimiento del procesamiento de imágenes ideal; los valores de correlación son obtenidos usando una correlación cruzada normalizada a cero (ZNCC, sigla en inglés).⁷

_{Figura 7: Esquema del método de extracción de la LSF 3D. Se extrajeron ocho LSF en la dirección XZ.}

El Monitor de rendimiento microscópico ejecuta automáticamente todas las otras tareas a excepción de aquellas que requieren la intervención manual, como configurar la lente de objetivos y también enfocar y centrar el patrón de arcos/aristas.

Tres técnicas exclusivas fueron usadas para medir la LSF 3D con alta precisión. Primero, se determinó intencionalmente el estenopo a dos unidades Airy con el fin detectar una mayor intensidad de luz reflejada, incluso durante desenfoques. Segundo, se usó una muestra con un mínimo de ocho pares de líneas (claras/oscuras) que se equiparan a un grafo estrella común, lo cual previene la interferencia con la luz reflejada proveniente de los pares adyacentes durante un desenfoque. Tercero, se formó un patrón de arcos/aristas extremadamente delgado, lo que permitió obtener respuestas de arcos/aristas cercanas a los valores teóricos. Estas técnicas dieron como resultado medidas LSF 3D más exactas y fiables.

La función de dispersión de punto (PSF, sigla en inglés), usada comúnmente para evaluar el rendimiento del procesamiento de imágenes, muestra cómo un solo punto aparece en la imagen y cómo puede capturar la degradación anisotrópica del rendimiento en el procesamiento de imágenes. Por su parte, la LSF muestra cómo las líneas son procesadas en imagen y omiten la degradación del rendimiento del procesamiento de imágenes en ciertas direcciones.

En el método antes descrito, la LSF 3D se adquiere a partir de ocho direcciones, lo que proporciona información que es casi equivalente a la PSF (PSF 3D). La Figura 8 muestra los resultados simulados de una PSF 3D y de una LSF 2D en ocho direcciones en las que hay aberración comática (o de coma), y cuya presencia se debe a cuando el objetivo está inclinado y, también, cuando el cubreobjetos o platina de la muestra están inclinados en relación con el objetivo.
La PSF 3D presenta una forma de banana, y la LSF 2D presenta una forma muy similar a esta última. Sin embargo, en ciertas direcciones, las aberraciones anisotrópicas —tales como la aberración comática— no son capturadas por la LSF 2D, y puede que parezca que no hay presencia de ellas. Sin embargo, al adquirir una LSF 2D a partir de ocho direcciones, es posible capturar información anisotrópica, de la misma forma que con la PSF 3D.

_{Figura 8. Comparación de una PSF 3D y una LSF 3D obtenidas por simulación}

Para verificar cuantitativamente que la LSF en ocho direcciones está al mismo nivel de la PSF, se calculó el cociente de Strehl de la PSF y la ZNCC de la LSF mientras se variaba la cantidad de aberraciones comáticas y esféricas. El cociente de Strehl es un valor que indica cuantitativamente la intensidad de luz reunida y cuya definición se expone como el cociente de la intensidad central en la PSF del sistema óptico en curso cuando la intensidad central de una PSF idónea, obtenida mediante un sistema óptico sin aberraciones, es del 100 %. El cociente de Strehl también es conocido por estar correlacionado con la aberración de frente de onda: un indicador del control de calidad de la lente de objetivo.

La aberración comática es una de las aberraciones que ocurre cuando se usa un microscopio, tal como descrito previamente; y, la aberración esférica es otro tipo de aberración que puede presentarse por un ajuste inadecuado del collar de corrección de la lente de objetivo, al usar un medio de inmersión incorrecto o al adherir accidentalmente líquido en el objetivo o superficie de la muestra. El grafico muestra los efectos de dichas aberraciones. Los valores de la ZNCC son promedios de los resultados calculados a partir de ocho direcciones. También, como referencia, se muestra el gráfico que compara la anchura de media altura (FWHM, sigla en inglés) de la PSF con el cociente de Strehl. El cociente de Strehl y la FWHM son dos indicadores cuantitativos de la PSF.

El gráfico de la Figura 9 muestra que existe una alta correlación entre el cociente Strehl de la PSF y la ZNCC de la LSG, con un alto coeficiente de determinación R2 de 0,959 en progresión lineal. Esto indica que la ZNCC de la LSF 3D puede ser sustituida por el cociente de Strehl de la PSF 3D. Aparte de ello, cuando existe una correlación entre la FWHM y el cociente de Strehl, se sugiere tener cuidado para determinar un valor de umbral uniforme. Por ejemplo, cuando la anchura de media altura medida (FWHM) es de 340 nm, puede asumirse que no hay problema con el rendimiento a nivel del procesamiento de imágenes, ya que el valor es próximo al valor teórico de 320 nm; pero, puede darse que el cociente de Strehl se reduzca a un 65 % debido a la aberración esférica. No obstante, la ZNCC que se calcula a partir de la LSF 3D puede usarse para determinar el rendimiento de formación de la imagen con mayor fiabilidad que con la FWHM de la PSF.

La medición directa del cociente Strehl, otro índice, requiere un dispositivo por separado para medir la aberración del frente de onda a partir del microscopio; esto plantea una dificultad al usuario al querer medirla directamente. En lugar de ello, los usuarios pueden usar la ZNCC para determinar el rendimiento del procesamiento de imágenes.

_{Figura 9. Relación entre el cociente de Strehl calculado a partir de la PSF 3D, la ZNCC calculada a partir de la LSF 3D (arriba) y la FVHM calculada a partir de la PSF 3D (abajo).}

El detonante asociado al rendimiento del procesamiento de imágenes para la realización de un mantenimiento es el cociente de Strehl en caída hasta el 80 %. Por lo general, un cociente de Strehl al 80 % se define como el límite de difracción; y, una lente de objetivo con el cociente de Strehl por debajo del 80 % se presenta con un rendimiento poco satisfactorio. Se recomienda que los usuarios ejecuten una verificación del rendimiento del procesamiento de imágenes cada vez que inician el sistema FV4000. También, se aconseja llevar a cabo esta verificación si el usuario cambia o después de 24 horas de uso.
 

Aplicaciones del Monitor de rendimiento microscópico

La Figura 10 muestra los resultados de una evaluación cuantitativa aplicada a una muestra de control bajo un experimento de cuantificación de fluorescencia. La muestra de control difiere según el experimento. Sin embargo, en este ejemplo, se define como la muestra usada para alinear la intensidad con el estándar de fluorescencia. En este caso, el segundo experimento se ejecutó un mes después que el primero. El primer experimento se llevó a cabo tras haber determinado las condiciones de la observación con fluorescencia y el segundo se ejecutó inmediatamente después de encender el instrumento.

Si bien los microscopios confocales se dotan de láseres que requieren un precalentamiento en función de las especificaciones del fabricante, estos dos experimentos se realizaron inmediatamente después del encendido a fin de exponer claramente el efecto. El gráfico en la Figura 10 compara la intensidad de fluorescencia entre la primera y la segunda muestra con y sin el Monitor de rendimiento microscópico.

Los resultados muestran que, si no se ejecutó una corrección con ayuda del Monitor de rendimiento microscópico, el rendimiento es inestable inmediatamente después de encender el instrumento y los datos fluctúan de modo general. A diferencia de ello, si la corrección se realiza, la cuantificación de la fluorescencia es posible con alta exactitud, incluso si el experimento se ejecuta entre días.

_{Figura 10. Variación en la intensidad de fluorescencia de las muestras de control durante el experimento de dos días}
 

Resumen

El Monitor de rendimiento microscópico otorga prestaciones de mantenimiento semiautomático para el microscopio confocal de escaneo láser FV4000. Esto mejora la eficiencia del servicio de mantenimiento y elimina la necesidad de capacitar a otros usuarios para dicha tarea. Por otra parte, el sistema libera a los usuarios del tiempo que pueden ocupar diagnosticando y solucionando problemas; los datos claros que ofrece facilitan la comunicación con el fabricante sobre lo que no funciona correctamente con el sistema microscópico, lo que ayuda además a reducir paradas. Un beneficio adicional es que los datos proporcionados por el Monitor de rendimiento microscópico permiten educar a los usuarios acerca de la importancia de precalentar el equipamiento, ajustar el collar de corrección de la lente de objetivo, así como definir las fluctuaciones de la potencia láser emitida a partir del objetivo.

En el caso de aquellos investigadores que usan un sistema microscópico confocal de escaneo láser, monitorizar con antelación el rendimiento de su microscopio con respecto a las fluctuaciones de la intensidad de fluorescencia llega a reducir significativamente la variabilidad en la cuantificación de fluorescencia, lo que permite obtener imágenes más uniformes y datos cuantitativos. La capacidad de medición semiautomática del Monitor de rendimiento microscópico procura que usuarios principiantes en el uso de microscopios puedan llevar a cabo dichas mediciones fácilmente. Además, cabe señalar que si los resultados experimentales no son los esperados, es posible identificar si los problemas provienen del microscopio o de la muestra.

Consideramos que, además de mejorar la reproducibilidad de los experimentos llevados a cabo por un solo usuario, también es necesario asegurar la reproducibilidad de los documentos de investigación para los investigadores. Por consiguiente, Evident continuará sus esfuerzos para mejorar la trazabilidad de sus datos de medición a nivel del rendimiento microscópico.

*Este contenido se basa en el desarrollo técnico llevado por el Centro de Colaboración Abierta entre el Instituto de RIKEN CBS y EVIDENT (BOCC) y la solicitud de patente presentada.
 

Autor

Yasuo Yonemaru
Tecnología avanzada, I+D, Evident Corporation

1. G. Nelson, et al. «QUAREP-LiMi: A community-driven initiative to establish guidelines for quality assessment and reproducibility for instruments and images in light microscopy», Journal of Microscopy, vol. 284 (1), pág. 56–73, (2021).
2. U. Boehm, et al. «QUAREP-LiMi: A Community Endeavor to Advance Quality Assessment and Reproducibility in Light Microscopy», Nature Methods, vol. 18, pág. 1423–1426. (2021).
3. H. K. Jambor. «A Community-Driven Approach to Enhancing the Quality and Interpretability of Microscopy Images» Journal of Cell Science, vol. 136 (24), jcs261837, (2023).
5. ISO 21073-2019 «Optical data of fluorescence confocal microscopes for biological imaging»
6. O. Faklaris, et al. «Quality Assessment in Light Microscopy for Routine Use through Simple Tools and Robust Metrics», Journal of Cell Biology, vol 221 (11), e202107093, (2022).
7. Lewis, J. P. «Fast Normalized Cross-Correlation», Industrial Light & Magic, 1995.