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En un proyecto de colaboración con RIKEN (Centro de Biología Cuantitativa, Japón), Olympus Corporation (Presidente: Hiroyuki Sasa), a través de su división comercial Scientific Solutions, ha desarrollado una nueva tecnología de microscopía por fluorescencia de super resolución que permite observar la ultraestructura de células vivas con una significativa reducción del tiempo de adquisición de las imágenes.

Al realizar observaciones al microscopio, existen ciertos límites en la resolución espacial,^*1, i.e., la capacidad de observar un objeto de forma muy detallada y la resolución espacial de un microscopio óptico genérico es de unos 200 nm como máximo.^*2 La microscopía de super resolución ha superado estos límites y permite observar estructuras más pequeñas.El Premio Nobel 2014 de Química fue dado a los investigadores de técnicas de microscopía por fluorescencia de super resolución por su innovadora invención que ha permitido importantes progresos en la investigación de las ciencias biológicas.

Nuestra nueva tecnología permite alcanzar una resolución espacial de unos 100 nm, equivalente a la que se logra mediante la microscopía de iluminación estructurada (SIM),^*3 una de las diversas técnicas de microscopía por fluorescencia de super resolución, con una resolución temporal de 1/100 segundos.^*4 La nueva tecnología permite obtener imágenes de la veloz dinámica de las organelas^*5 que se mueven activamente dentro de las células vivas. Este logro había resultado inalcanzable usando técnicas convencionales de fluorescencia de super resolución, ya que el tiempo necesario para adquirir las imágenes varía entre 1 segundo y varios minutos.Se prevé que este gran adelanto en la microscopía por fluorescencia de super resolución amplíe nuestra comprensión de varios fenómenos biológicos.

Esta tecnología puede logra modificando los microscopios confocales convencionales *6 y se espera que el dispositivo pueda instalarse fácilmente, en comparación con otros microscopios por fluorescencia de super resolución preexistentes.

La versión en línea del artículo sobre esta tecnología se publicó el 25 de febrero, antes que la edición impresa que se publicara en el número del 1 de mayo de "Molecular Biology of the Cell", la revista de la American Society for Cell Biology.

Notas:
*1: Capacidad de distinguir dos puntos o dos líneas. Los valores más pequeños indican una resolución espacial más alta, que permite observar estructuras más pequeñas.
*2: Un nanómetro (nm) es igual a la millonésima parte de un milímetro
*3: Método que puede aumentar la resolución espacial hasta un factor de 2 comparado con la microscopía convencional, mediante el análisis de los patrones de interferencia de moiré de 9 a 25 imágenes, que se forman al proyectar patrones de franjas.
*4: El tiempo mínimo en el que se genera un cambio distinguible en la imagen bajo observación. Los valores más pequeños indican una resolución temporal más alta, que permite distinguir las imágenes que cambian a gran velocidad
*5: Complejos subcelulares con funciones y estructuras específicos, como el retículo endoplasmático, los cuerpos de Golgi y las mitocondrias.
*6: Tipo de microscopio que permite crear imágenes en tres dimensiones enfocando un haz de excitación en una muestra y bloqueando cualquier luz fluorescente que no proceda del punto focal.

División comercial Scientific Solutions:
Los principales productos de la división Scientific Solutions de Olympus incluyen microscopios ópticos, endoscopios industriales y dispositivos para ensayos no destructivos.Olympus contribuye a la investigación y el desarrollo en el campo de la salud, de las ciencias biológicas y de la industria, al mejoramiento del control de calidad en centros de producción, y a la seguridad y confiabilidad de las infraestructuras sociales a través de la inspección de aeronaves y grandes plantas industriales.

(Materiales de referencia: resumen de investigación)

<Antecedentes>:
En el siglo XIX, un físico alemán de nombre Ernst Abbe y otros científicos demostraron que la resolución espacial de un microscopio óptico se limita aproximadamente a la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada (límite de difracción), y que creyó por mucho tiempo que el objeto más pequeño que podía observarse usando un microscopio de luz visible era de 200 nm.Sin embargo, a partir del año 2000 se desarrollaron varios microscopios de fluorescencia de super resolución con la finalidad de alcanzar una resolución espacial que superase el límite de difracción.Esto llevó a alcanzar una resolución espacial de 100 nm o menos.No obstante, estas técnicas de microscopía de super resolución requieren un tiempo considerable para crear imágenes, por lo que no resultan adecuadas para obtener imágenes de células vivas.En este estudio, por lo tanto, nos hemos centrado en el desarrollo de un microscopio con una resolución temporal de 1/100 seg, que posibilita la obtención de imágenes de células vivas.

<Tecnología>:
El análisis se centró en la microscopía de iluminación estructurada (SIM), una de las técnicas convencionales de microscopía por fluorescencia de super resolución. Se han detectado similitudes teóricas entre la obtención de imágenes por SIM y por microscopía confocal.Hemos estudiado este tema utilizando nuestra unidad de barrido por disco (DSU) y hemos advertido que pueden obtenerse imágenes de super resolución con una calidad equivalente a las de SIM si se modifica el patrón de franjas en un disco giratorio.Por este motivo hemos denominado a esta técnica "Microscopía de super resolución por disco giratorio (SDSRM)" (Figura 1).
Luego se utilizaron microesferas fluorescentes para probar la resolución espacial del sistema en un experimento diseñado para verificar el principio. El resultado hallado, en coincidencia con los cálculos teóricos, es que podría alcanzarse una resolución espacial de unos 100 nm (Figura 2). Incluso hemos logrado observar la ultraestructura de células vivas con una resolución espacial de 100 nm, a una velocidad máxima de obturación de 1/100 seg (resolución temporal) cambiando la fuente de iluminación y la cámara por otras más adecuadas para la obtención de imágenes a alta velocidad.

Figura 1. Diagramas esquemáticos de un microscopio de super resolución por disco giratorio
Izquierda: Esquema de la trayectoria de luz.La luz de iluminación (indicada en azul) y la luz procedente de la muestra (indicada en verde) pasan por la misma posición en el disco, creando un efecto confocal.
Derecha: Diagrama esquemático de un patrón de franjas en un disco.La observación con super resolución fue posible gracias a la creación de un patrón de franjas más finas que en los patrones convencionales.

Figura 2. Experimento de prueba de concepto utilizando microesferas fluorescentes
Izquierda: Imagen obtenida con un microscopio de fluorescencia convencional
Derecha: Imagen obtenida con el microscopio de super resolución por disco giratorio
(barra de escala, 500 nm)

<Resultados>
El desarrollo de la técnica de microscopía de super resolución por disco giratorio ha permitido observar la dinámica de la ultraestructura en células vivas. Puesto que esta técnica puede lograrse modificando un microscopio confocal convencional, la introducción del dispositivo resulta más sencilla en comparación con otras técnicas de microscopía por fluorescencia de super resolución preexistentes.El desarrollo ulterior del principio de la técnica de microscopía de super resolución por disco giratorio debería permitir su aplicación a otras técnicas de microscopía confocal.

Información sobre este artículo
Título: Obtención de imágenes ultra rápidas por fluorescencia de super resolución con la óptica del microscopio confocal de disco giratorio
Autores: Shinichi Hayashi y Yasushi Okada
Revista: Molecular Biology of the Cell
DOI:10.1091/mbc.E14-08-1287 (publicado en línea antes de la impresión)

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