Sistemas de escaneo en microscopio confocal

El procesamiento de imágenes confocal se basa en la recopilación secuencial de luz a partir de puntos de muestra individuales filtrados espacialmente, seguida del procesamiento de señales electrónicas y, en última instancia, de la visualización de los puntos de imagen correspondientes. El proceso de recopilación de señales punto por punto requiere un mecanismo para escanear el haz de iluminación enfocado a través del volumen de la muestra bajo observación. Por lo general, se emplean tres variaciones principales de escaneo para producir imágenes de microscopía confocal. La operación confocal en su equivalencia básica puede llevarse a cabo mediante la traslación lateral de una platina de muestras que se acopla a un haz de luz de iluminación estacionario (barrido/escaneo de platina), un haz de luz escaneado con una platina estacionaria (barrido/escaneo de haz), o al mantener tanto la platina como la fuente de luz estacionarias mientras se escanea la muestra usando una serie de puntos de luz transmitidos a través de las aberturas de un disco Nipkow giratorio (ver Figura 1 y Figura 2). Cada técnica presenta características de rendimiento que la hacen ventajosa para aplicaciones confocales específicas, pero que limitan su utilidad en otras.

Las configuraciones de escaneo/barrido de platina y de haz son métodos de un solo haz, mientras que el enfoque de disco giratorio emplea una técnica de escaneo de múltiples haces. Los sistemas que emplean el concepto de escaneo con el disco Nipkow por lo general han usado fuentes de luz de amplio espectro no coherentes (p. ej., lámparas de arco de descarga) para la iluminación en lugar de láseres; por tanto, la falta general de brillo ha limitado severamente su uso en aplicaciones de fluorescencia. Sin embargo, las modernas redes de microlentes y las mejoras avanzadas en el diseño del disco, junto con la iluminación láser, han ampliado el potencial aplicativo de los microscopios confocales de disco giratorio. Los sistemas de disco Nipkow pueden ser diseñados en las variaciones de escaneo en tándem o monoescaneo. En el primero, los haces de iluminación y detección siguen trayectorias en tándem a través de conjuntos separados de aberturas idénticas, las cuales están ubicadas en lados diametralmente opuestos del disco. El sistema de monoescaneo ilumina y detecta simultáneamente a través de cada apertura giratoria en el disco; esto conserva la correspondencia que exhiben las dos trayectorias de luz al atravesar el objetivo.

Existe también un método de escaneo adicional de un solo haz que ha experimentado una aplicación limitada en los microscopios de luz reflejada especializados, principalmente ha sido usado en la inspección de circuitos integrados. El propio objetivo puede ser escaneado sobre una muestra estacionaria gracias a una fuente de luz estacionaria en un sistema de lentes de escaneo. Esta configuración ofrece ventajas ópticas similares a las del escaneo de platina, pero permite que la muestra estacionaria se adapte a sondas de medición o sea manipulada de otra manera. La configuración no se adapta a un escaneo rápido cuando se emplea un objetivo convencional relativamente masivo; por ende, no es usada ampliamente.

El microscopio confocal moderno es un sistema electrónico integrado, basado frecuentemente en un instrumento de epifluorescencia de campo amplio; este se dota de múltiples fuentes de iluminación láser, un cabezal de escaneo formado por componentes electrónicos y ópticos, así como de un PC y un monitor para la visualización de imágenes y un software asociado para controlar la adquisición de señales, el procesamiento y el análisis de imágenes. En el caso de la configuración confocal básica, el objetivo forma una imagen a partir de los estenopos de la fuente y del detector en el plano de la muestra. Cuando los estenopos son colocados en el eje óptico del microscopio, dentro de los planos focales conjugados, las imágenes se superponen dentro del plano focal de la muestra. Si bien hay excitación por parte de los fluorocromos que se hallan fuera del plano de enfoque, la detección se ve limitada a la emisión que ocurre cerca del plano focal a través de la abertura del estenopo del detector, el cual rechaza la luz fuera de foco. En este escaneo por puntos, el microscopio confocal de escaneo láser funciona como un dispositivo de muestreo y no forma una imagen óptica (real). Para permitir la formación de imágenes, el punto de muestreo debe moverse a través de la muestra y la señal resultante debe ser recopilada y almacenada. El cabezal de escaneo controla la generación de la señal de fotones requerida para construir la imagen confocal. La Figura 1 ilustra los componentes de un típico cabezal de escaneo comercial. Por lo general, este presenta una o más entradas de láser, conjuntos de filtros de fluorescencia, un mecanismo de escaneo de trama, aberturas variables de estenopos y detectores (habitualmente, tubos fotomultiplicadores o PMT) dedicados a detectar múltiples longitudes de ondas de fluorescencia.

Para ampliar el principio confocal del muestreo por puntos a fin de generar un campo de imagen más amplio para la muestra, el enfoque puntual en la muestra es escaneado mediante un patrón de trama similar al empleado para crear la imagen en una pantalla de televisión (y en otras aplicaciones de video). Vea la Figura 2(a). Este mecanismo requiere un escaneo horizontal rápido (escaneo lineal) junto con un escaneo vertical más lento, o escaneo de trama, que desplaza la línea de escaneo a posiciones secuenciales desde la parte superior hasta la parte inferior de la trama. A lo largo del desarrollo histórico del microscopio confocal, se han empleado varias técnicas para implementar el escaneo por puntos, y varias han ido perfeccionándose a través de las versiones comerciales actuales. En los instrumentos de escaneo láser de un solo haz, un mecanismo de escaneo de trama típico utiliza dos espejos oscilantes de alta velocidad impulsados por motores galvanométricos, que giran sobre ejes perpendiculares entre sí. La coordinación de los dos espejos, uno para el escaneo a lo largo del eje X y el otro a lo largo del eje Y, produce el escaneo de trama rectilíneo. La velocidad de escaneo de los espejos es insignificante en comparación con la velocidad de la luz; por tanto, la fluorescencia emitida puede ser recogida y devuelta por el objetivo, o descaneada, a lo largo de la trayectoria de iluminación original hasta su plano focal conjugado con el estenopo del detector. La variación en la intensidad de la señal que ilumina la abertura del detector corresponde a variaciones de emisión a partir de los diferentes puntos de una muestra a medida que se escanea el haz de excitación.

En la práctica, muchas de las características de un sistema de escaneo confocal idóneo, que son necesarias para proporcionar un óptimo rendimiento de imagen, son extremadamente difíciles de lograr. Casi todas las configuraciones del sistema de escaneo presentan alguna deficiencia en el funcionamiento; en un intento por corregir estas deficiencias, varias modificaciones se han ido introduciendo a nivel del diseño óptico y electrónico. Muchos métodos que implementan el escaneo por puntos reducen la sensibilidad o comprometen gravemente la flexibilidad o la calidad de la imagen; por ello, no se utilizan actualmente en los sistemas de producción comercial. Uno de los requisitos más importantes del diseño del sistema de escaneo es que la pupila del objetivo (abertura focal posterior) esté completamente llena de luz durante todo el ciclo de escaneo para evitar que la iluminación disminuya en los extremos de este último. Esto se logra mejor al minimizar el movimiento del haz en la abertura mediante un diseño de escaneo que hace oscilar el haz en un punto estacionario conjugado con la apertura trasera del objetivo. Mantener un punto pivote estacionario cuando el haz es sacudido durante el escaneo representa un desafío técnico; algunos sistemas compensan una pequeña cantidad de movimiento del haz con el sobrellenado de la abertura mediante una mayor expansión del haz. Pero, la desventaja es que se desperdicia luz y se reduce la eficiencia de los fotones del sistema.

Una propiedad adicional y deseable del mecanismo de escaneo confocal es escanear a la velocidad de refresco más alta posible con el fin de obtener flexibilidad al ajustar varios modos de escaneo para que coincidan con la aplicación de procesamiento de imágenes. Esto requiere un nivel mínimo de inercia por parte de los componentes móviles que ejecutan el escaneo del haz, como también la reducción del tiempo muerto del sistema (o intervalo entre cada ciclo de exploración) en el que el haz no está escaneando la muestra. La proporción de cada intervalo de escaneo a fotograma completo que sirve para escanear realmente la muestra se denomina ciclo de trabajo del sistema. Paliar el escaneo no productivo del haz no solo es esencial para lograr una alta velocidad de refresco de fotogramas, sino que también, en algunos diseños de instrumentos, reduce el daño innecesario a los fotones de la muestra resultante de una mala especificación en el ciclo de trabajo.

La capacidad para rotar libremente la trama de escaneo alrededor del eje óptico es una característica muy importante en el procesamiento de imágenes confocales como medio para optimizar la dirección de escaneo con respecto a la forma de la muestra u otras características. Cuando se procesan imágenes de características alargadas, como los haces de fibras, la orientación del rápido escaneo en paralelo al largo eje de la característica mejora en gran medida la resolución temporal de la señal de la muestra. Asimismo, la capacidad de girar la trama permite orientar las características de la muestra usando en cierto modo el campo de la imagen de una manera más eficiente. Una disposición de escaneo que no permita girar la dirección de la trama puede limitar seriamente la practicidad del sistema, a menos que la propia muestra pueda ser girada fácilmente: una operación mucho más compleja que, por lo general, no es factible.

La disposición óptica que se requiere para producir un movimiento lineal del punto de iluminación en la muestra deriva del alcance de los componentes geométricos del microscopio, como el objetivo que se corrige telecéntricamente: un sistema de lentes telecéntricas coloca las pupilas de entrada y salida en el infinito. Para ejecutar la completa corrección óptica del objetivo, los planos de la imagen y de la muestra deben permanecer a distancias fijas a partir del objetivo; por consiguiente, se conocen las ubicaciones de los planos de imagen y planos telecéntricos conjugados. Una propiedad óptica fundamental es que todos los haces de luz unen un plano telecéntrico a un ángulo que es una función de la posición del punto de origen en el plano de la muestra. Puesto que un espejo plano es capaz de cambiar el ángulo de propagación de un haz de luz, la colocación de un espejo dentro de un plano telecéntrico conjugado en el eje óptico proporciona un mecanismo para que se produzca un cambio en el ángulo del haz que llevará a un movimiento lineal del punto focal en la muestra. Por lo tanto, en el caso más simple, el posicionamiento de un espejo con su punto de pivote dentro del centro del plano telecéntrico conjugado del objetivo produce un escáner de haz unidimensional capaz de cambiar la posición del punto iluminado en el plano de la muestra en función del ángulo pivote del espejo. Cualquier plano telecéntrico conjugado es una imagen del plano telecéntrico del objetivo. Si se emplea un sistema óptico intermedio, se forma una imagen del espejo en la abertura de entrada del objetivo, lo que mantiene las propiedades telecéntricas.

En teoría, este concepto de escaneo puede expandirse a dos ejes perpendiculares al escanear simultáneamente el espejo en dos direcciones o al agregar un segundo espejo, aunque por lo general son las consideraciones prácticas las que determinan el tipo de enfoque adoptado para un diseño de sistema general en particular. Cuando se emplean dos espejos a fin de escanear el haz en direcciones perpendiculares, es necesario colocarlos en planos telecéntricos conjugados o, alternativamente, ubicarlos muy cerca uno del otro (acoplamiento cerrado). Mediante la desviación del haz en direcciones ortogonales, un sistema de escaneo de este tipo posibilita movimientos rápidos y lentos de escaneo a lo largo de los ejes X e Y, requeridos para formar una imagen bidimensional completa.

Es posible determinar una variada disposición de los componentes del sistema de escaneo siempre que se satisfagan los requisitos fundamentales. Para asegurar el rendimiento limitado por difracción del sistema óptico, el plano focal posterior del objetivo (abertura de entrada) debe llenarse de manera uniforme y contante con una onda plana durante el escaneo. Debido a que el diámetro físico de esta abertura varía con las propiedades del objetivo, todos los demás componentes, como los estenopos de iluminación, deben coincidir con los objetivos en uso. Los planos telecéntricos conjugados pueden producirse en las ubicaciones requeridas al adicionar los componentes ópticos auxiliares; de adoptarse este enfoque, también se deben considerar cuidadosamente las propiedades de estos con respecto a su compatibilidad con los objetivos elegidos que se usan con el sistema. Las propiedades del haz de los láseres de iluminación, en particular el diámetro del perfil del haz gaussiano, son factores relevantes al ajustar el diámetro del estenopo y otras variables relacionadas con la iluminación de la apertura de entrada del objetivo.

En la configuración más simple del haz a partir del escaneo confocal, hay un espejo de escaneo ubicado en el plano focal posterior de una lente de escaneo, la cual se conjuga con el plano focal posterior del objetivo. En la Figura 3(a) se ilustra la disposición de un solo espejo, que incluye la lente de tubo requerida por un objetivo corregido al infinito. El escaneo uniaxial se logra fácilmente mediante esta configuración. Teóricamente, el medio idóneo para lograr el escaneo X e Y es el escaneo de un solo espejo en ambos ejes simultáneamente (refiriéndose al escaneo cardánico). Por lo general, se emplean dos espejos de escaneo; y las dos configuraciones posibles de este tipo se ilustran en las Figuras 3(b) y 3(c). Si los espejos están estrechamente acoplados [Figura 3(b)], el sistema puede funcionar satisfactoriamente sin requerir la intervención de componentes ópticos adicionales. Si se presenta una distancia de separación mucho mayor entre los espejos de escaneo [Figura 3(c)], debe usarse un sistema de relé telecéntrico dotado de múltiples lentes para optimizar el rendimiento óptico.

A pesar de que el mecanismo para lograr el escaneo de trama X e Y es considerado el aspecto más importante del sistema de escaneo confocal, se requiere algún método de escaneo axial Z con el fin de adquirir series de secciones ópticas para procesar imágenes tridimensionales y recopilar imágenes 2D de X y Z o de Y y Z, como también para ejecutar cualquier forma de escaneo en línea libre Z. Las configuraciones microscópicas típicas cambian la distancia entre el objetivo y la muestra al trasladar el objetivo o la platina del microscopio. El movimiento puede ejecutarse con precisión mediante un controlador piezoeléctrico o un dispositivo galvanométrico, aunque en un rango de distancia limitado. Sin embargo, lo más común es que se utilice un motor de micropasos para orientar el enfoque fino del microscopio; en los instrumentos modernos, los motores paso a paso son capaces de posicionar el enfoque en un tamaño de paso mínimo por mandato de 10 nanómetros. Para aplicaciones de fluorescencia biológica, el posicionamiento en Z según esta precisión es más que adecuado.

Los avances tecnológicos en los instrumentos de un solo haz han favorecido el desarrollo de instrumentos de escaneo rápido; estos proporcionan imágenes a velocidades de captura de vídeo para seguir los procesos dinámicos en las células vivas. Los escáneres rotativos de espejo poligonal pueden alcanzar velocidades de escaneo muy altas y se utilizan en muchos dispositivos ópticos; sin embargo, no proporcionan la iluminación ni la precisión de detección requeridas para una implementación en la microscopía de alta resolución. Asimismo, se han analizado varias configuraciones que combinan espejos de escaneo con deflectores acústico-ópticos (AOD). En ciertas disposiciones, un AOD proporciona un escaneo muy rápido en un eje, mientras que un escáner de espejo controla el eje más lento. Este enfoque es aceptable en algunas aplicaciones; sin embargo, resulta problemático en el procesamiento de imágenes de fluorescencia confocal debido a que no permite que la emisión de fluorescencia de longitud de onda más larga vuelva a descanearse a través del modulador acústico-óptico, el cual es específico para la longitud de onda. La señal parcialmente desescaneada, que permanece oscilante en un eje, puede pasar a un fotomultiplicador a través de una abertura de ranura, o puede ser visualizada en un detector CCD de matriz lineal. Si bien las imágenes resultantes son confocales en un solo eje, las características son aceptables para algunas aplicaciones. Un enfoque más habitual con respecto al alcance de altas frecuencias de refresco en un sistema de un solo haz es el uso de escáneres de espejo resonante de rápida oscilación. Gran parte de los fabricantes más reconocidos han incorporado escáneres resonantes como una opción de escaneo estándar para favorecer la frecuencia de captura videográfica a velocidades de 30 fotogramas por segundo a partir del campo visual completo. Al recortar en Y, los escáneres resonantes permiten velocidades de varios cientos de fotogramas por segundo para aplicaciones que requieren una alta resolución temporal, como el flujo sanguíneo capilar o la dinámica del calcio.

Las técnicas de escaneo de múltiples haces ofrecen una alternativa a las configuraciones de escaneo de un solo haz, aunque la baja eficiencia de iluminación haya limitado previamente su uso en aplicaciones de fluorescencia de alta resolución. Ya sea en la variación del escaneo en tándem o del monoescaneo, los escáneres de disco giratorio introducen cientos de orificios, que funcionan como estenopos de iluminación y detección, en el plano de imagen intermedio del microscopio. La Figura 2(b) presenta la configuración de un típico sistema de escaneo de disco Nipkow. Los orificios del disco están dispuestos de modo a que una gran cantidad de haces escanee uniformemente el campo de la imagen a medida que gira el disco, cubriendo completamente la muestra a una velocidad mucho mayor que la de los escáneres de un solo haz. Dado que los microscopios de barrido/escaneo de disco forman una imagen real, es posible que una cámara CCD o CMOS sea integrada directamente en el plano de la imagen; esta recopilará la señal emitida con una eficiencia cuántica mucho mayor que la exhibida por los tubos fotomultiplicadores. A pesar de esta ventaja, que permite un dinámico enfoque y procesamiento de imágenes en tiempo real, varias deficiencias han limitado la utilidad práctica de los sistemas confocales de escaneo de disco. Antes, una de las deficiencias más graves era la típica dependencia a las fuentes de luz convencionales de amplio espectro y la extrema pérdida de luz que se producía en el disco. Sin embargo, los avances en el diseño de sistemas de discos y la aplicación de fuentes láser han ayudado a superar algunos de estos problemas de eficiencia. En efecto, cada disco presenta orificios de tamaño fijo y el diámetro del estenopo no puede coincidir con el objetivo específico en uso; por consiguiente, esto hace que la elección de objetivos para un funcionamiento óptimo con un disco determinado se vea limitada. Por otra parte, no es posible optimizar el diámetro de los estenopos de la fuente ni del detector de forma independiente.

Una técnica que mejora la falta de brillo, tan característica de los primeros sistemas con discos Nipkow, es el uso de microlentes para intensificar la fuente de luz. Los sistemas más antiguos transmitían aproximadamente sólo el 1 % de la iluminación incidente en el disco y requerían el uso de cámaras CCD o CMOS refrigeradas para compensar el bajo nivel de señal. Los diseños de los microscopios modernos para el escaneo/barrido con disco incorporan un segundo disco que contiene miles de microlentes; estos giran en alineación con el disco Nipkow y amplifican la luz que pasa por ambas direcciones a través de las aberturas del disco Nipkow. Gracias a los avances de la tecnología de microlentes, láser y cámaras, los microscopios de escaneo/barrido de disco se han convertido en una herramienta indispensable para las aplicaciones de procesamiento de imágenes de células vivas.

Conclusiones

En vista de mejorar algunos aspectos en el rendimiento práctico de los instrumentos confocales, se han llevado a cabo varias modificaciones de escáner adicionales. Cada aspecto de la microscopía de fluorescencia confocal está fundamentalmente relacionado con la eficiencia y las limitaciones inherentes de la recopilación de datos en serie. La eficiencia con la que puede adquirirse una señal útil define el equilibrio que debe alcanzarse entre el contraste de la imagen y el fotodaño de la muestra, asimismo controla el tratamiento requerido para la recopilación de datos en serie entre la resolución espacial del escaneo de muestreo, la relación entre señal y ruido, y la frecuencia de adquisición de imágenes.

Para el procesamiento de imágenes de fluorescencia de alta resolución, la tecnología de escaneo más refinada y versátil que se halla actualmente disponible es una variación que utiliza escáneres galvanométricos; la mayoría de los principales fabricantes de microscopios producen al menos un instrumento confocal que emplea este método. Debido a lo importante que es la eficiencia de fotones, la relativa simplicidad de las técnicas de escaneo de un solo haz ofrece ventajas concluyentes sobre los escáneres de disco para la mayoría de las aplicaciones de fluorescencia. Son compatibles con una amplia variedad de sistemas ópticos de microscopios convencionales e instrumentos videográficos; se ajustan bien a los principios generales de la microscopía, y la flexibilidad en el ajuste del estenopo permite la optimización de variables ópticas y de muestra específicas.