Objetivos para microscopios confocales

Para cualquier configuración de microscopio óptico convencional, el objetivo es el componente más crítico del sistema a la hora de determinar el contenido informativo de la imagen. El contraste y la resolución de los detalles finos de la muestra, la profundidad dentro de la muestra a la que puede obtenerse la información y la extensión lateral del campo de imagen vienen determinados por el diseño del objetivo y su rendimiento en las condiciones específicas empleadas para la observación. Existen demandas adicionales impuestas en el objetivo para las técnicas de escaneo confocal, donde este componente fundamental del procesamiento de imágenes también sirve como condensador de iluminación y algunas veces tiene que operar con un alto grado de precisión en una amplia variedad de longitudes de onda y a niveles de iluminación muy bajos sin introducir ruido inaceptable que puede degradar la imagen.

Independientemente de la función de cualquier otro componente del sistema, no puede añadirse información a la imagen que no haya sido capturada inicialmente por el objetivo. Algunos componentes intermedios en la trayectoria de procesamiento de imágenes pueden llevar a cabo funciones correctivas, pero su requisito de rendimiento principal es que degraden la información esencial de la imagen recibida del objetivo lo menos posible. Tradicionalmente, las variables primarias consideradas en la selección del objetivo para una aplicación específica han sido la magnificación, tanto si se requiere un diseño seco o de inmersión, y la apertura numérica del sistema de la lente. El desarrollo de nuevas técnicas de procesamiento de imágenes impulsado por las mejoras tecnológicas en los láseres, colorantes fluorescentes y nuevas funciones de marcado de muestras, además de las mejoras ópticas continuas por parte de los fabricantes de microscopios, han potenciado drásticamente el avance en algunas áreas de investigación. Ese sería el caso de la neurociencia y la biología molecular, y la microscopia confocal combinada con técnicas de fluorescencia que han pasado a ser herramientas de investigación de confianza.

En la Figura 1 podemos ver un objetivo de alto rendimiento diseñado específicamente para usarse con la iluminación láser desde las regiones violeta a infrarrojo cercano del espectro. El objetivo es un modelo 60X de inmersión en aceite (plano) aprocromático de campo plano, que está corregido para longitudes de onda que van de 405 a 1000 nanómetros. Entre las aplicaciones útiles para este objetivo podemos citar las observaciones de fluorescencia simultánea y de contraste de interferencia diferencial (DIC).

Las demandas generales impuestas en el objetivo del instrumento confocal son muy similares a las demandas de otras aplicaciones de microscopía crítica, aunque el creciente número de requisitos de las nuevas técnicas ha hecho que cada vez sea más común abordar los límites de rendimiento de estos sistemas de lentes. Las limitaciones específicas de algunas aplicaciones han dejado claro que otras características del objetivo también pueden ser igual de importantes, o más importantes, que las que tradicionalmente se han considerado primordiales. Para poder satisfacer los requisitos esenciales de las técnicas que actualmente parecen comprometedoras, los fabricantes han introducido nuevas ópticas pensadas específicamente para optimizar el rendimiento para estos métodos. El desarrollo de objetivos de inmersión en aceite de silicona con alta corrección y alta apertura numérica es un ejemplo en respuesta al aumento dramático de la investigación en tejidos y células vivas, que se realiza por necesidad en medios acuosos. Es posible que algunos requisitos específicos de la microscopía confocal permitan desarrollar ópticas que corrijan de forma menos rigurosa una o varias de las aberraciones que comprometen la resolución para poder conseguir otros objetivos de diseño que son más críticos en el rendimiento confocal.

Resolución del microscopio de barrido láser

La resolución en los sistemas ópticos se ha aceptado comúnmente como la distancia de separación mínima entre dos características de muestras que permiten distinguirlas como entidades separadas en la imagen final. La resolución se define sobre la base de un contraste específico necesario para el reconocimiento visual y puede cuantificarse como una función de la longitud de onda de la luz (λ) y la apertura numérica (NA) del sistema óptico. La interferencia entre los frentes de onda difractados a través de la apertura de la lente produce la distribución de la intensidad del disco de Airy en el plano de imagen, el diámetro de la cual (d) viene determinado por la siguiente ecuación, en el sistema idóneo limitado por la difracción:

d_Airy= 1,22 • λ/NA

El conocido criterio de Rayleigh considera dos puntos idénticos escasamente discernibles cuando están separados por la mitad del diámetro del disco de Airy. En consecuencia, el radio de Airy (r) es equivalente a la resolución lateral y se define modificando la ecuación anterior. Si se utiliza la epifluorescencia, el objetivo funciona como un condensador y un objetivo, por lo tanto en la siguiente expresión, NA representa la apertura numérica del objetivo:

r_Airy= 1,22 • λ/(2 • NA)

Las limitaciones de difracción que generan una redistribución lateral de la intensidad desde los objetos de punto en patrones de Airy también producen desenfoque a lo largo del eje óptico, que cambia el tamaño y la forma del punto de imagen. La función de dispersión del punto de intensidad tridimensional describe la distribución de intensidad y representa el rendimiento del sistema óptimo a la hora de transferir la información de la muestra al plano de imagen. Una gama de aberraciones ópticas son características de los sistemas de lente refractarias y cualquiera que no esté corregida por el diseño del objetivo o compensada por otro componente óptico, modificará la distribución de intensidad que representa cada punto de la muestra en la imagen, degradando la imagen en relación con el rendimiento idóneo limitado por la difracción. La importancia relativa de las aberraciones potenciales en aplicaciones confocales debe tenerse en cuenta a la hora de seleccionar los objetivos para la técnica. En las secciones siguientes explicaremos lo factores principales en el rendimiento y el diseño del objetivo, que pertenecen específicamente al microscopio confocal.

La configuración del microscopio confocal más usada para las aplicaciones biológicas emplea un sistema de barrido controlado informáticamente para desviar un haz de luz láser enfocado a través del objetivo, a lo largo de una muestra estacionaria. Este método se conoce como barrido confocal fuera del eje porque el haz escaneado se desvía a cada lado del eje óptico y utiliza las regiones periféricas de los elementos de la lente del objetivo. Algunas implementaciones tempranas de las técnicas de barrido en el microscopio óptico emplearon el barrido dentro del eje, en el que el haz láser permanecía fijo en el eje óptico y la platina de la muestra o el objetivo se escaneaban.

Aunque en principio los dos métodos de escaneo pueden producir resultados similares, los requisitos relacionados con la elección de un objetivo para lograr un rendimiento óptimo son bastante diferentes para el barrido de iluminación dentro del eje y fuera del eje, y las consideraciones para la recogida de fluorescencia emitida a través del objetivo también son diferentes. Un tercer tipo de escáner utiliza un disco de Nipkow giratorio para escanear varios puntos de iluminación en la muestra sin mover la fuente de luz ni la platina del microscopio. Los sistemas de Nipkow se utilizan ampliamente en las investigaciones con células vivas debido, con todo, a su capacidad de minimizar el daño celular en comparación con las configuraciones que emplean fuentes láser escaneadas de alta intensidad.

Las aberraciones de la lente que pueden afectar al rendimiento pueden dividirse en dos categorías, incluyendo las que no son cromáticas (invariables con longitud de onda) y las aberraciones cromáticas que dependen de la longitud de onda. Las aberraciones cromáticas se caracterizan como aberración cromática lateral o aberración cromática longitudinal, y el grupo que no depende de la longitud de onda incluye la aberración esférica, coma, astigmatismo, curvatura de campo y distorsión. Las aberraciones cromáticas y la aberración esférica afectan a todo el campo de imagen, mientras que el resto de aberraciones son más prevalentes en zonas fuera del eje. Las aberraciones cromática y esférica (consulte la Figura 2) son las que más probablemente afectarán negativamente al rendimiento confocal. En general, las aberraciones cromáticas no pueden modificarse de forma procedimental y deben tratarse en el diseño de los componentes ópticos. Otros artefactos, especialmente la aberración esférica, suelen exacerbarse por el uso inadecuado del objetivo o la introducción de componentes ópticos incompatibles, pero pueden minimizarse o compensarse adoptando las técnicas adecuadas o realizando ajustes en el sistema óptico.

Aberración esférica

La aberración esférica es la aberración no cromática más significativa para el rendimiento confocal, y se trata de una manifestación de la propiedad de los componentes de las lentes esféricas que hace que los rayos de luz paraxial y periférica se enfoquen en planos sucesivos. Un grado variable de refracción para trayectorias de luz a través de las distintas zonas de la lente genera borrosidad en la imagen enfocada de un punto de origen, y produce un cambio de intensidad asimétrico por encima y por debajo del plano focal. En todos los objetivos modernos, la aberración esférica se corrige hasta niveles visualmente imperceptibles si las variables operativas especificadas para el diseño del objetivo se satisfacen de forma exacta. Lamentablemente, existen diversas posibilidades en la práctica para permitir la desviación de los criterios del diseño óptico del objetivo, así como para inducir una aberración esférica. Dado que la aberración esférica solo puede corregirse correctamente para una relación de distancia especificada de forma precisa entre el objetivo y los planos de la imagen y de la muestra, el artefacto puede introducirse accidentalmente si la longitud de tubo especificada para el objetivo no se mantiene. Esto puede ocurrir si el objetivo se utiliza en un microscopio que no tiene la longitud del tubo requerida en un sistema con corrección finita, o mediante la introducción de elementos ópticos como filtros en la trayectoria del haz convergente en un sistema con esas características.

La corrección óptima de la aberración esférica requiere una atención cuidadosa del medio de imagen externo al objetivo, y esta es otra fuente potencial de reducción del rendimiento. Las características del objetivo vienen fijadas desde la fase de diseño y no pueden adaptarse a condiciones de funcionamiento distintas (a excepción de los ajustes proporcionados por los collares de corrección). Entre los factores que pueden añadir una aberración esférica considerable podemos citar el aceite de inmersión de baja calidad entre el objetivo y la muestra, el grosor no estándar de la cubierta de vidrio, el medio de montaje de la muestra y la propia muestra. Cualquier material que penetre entre la muestra y la superficie de la lente frontal del objetivo pasa a ser un componente crítico del sistema de procesamiento de imágenes. El cumplimiento de los requisitos de diseño del objetivo pasa a ser todavía más importante si la apertura numérica es alta. Las variaciones en el grosor de la cubierta de vidrio o en su índice de refracción pueden aumentar la aberración esférica, especialmente con objetivos "secos" (no de inmersión). Los objetivos secos de alta apertura numérica suelen diseñarse para alcanzar un rendimiento óptimo con una cubierta de vidrio de 0,17 milímetros de espesor, con la muestra montada directamente debajo y en contacto con el vidrio.

Para permitir la corrección de la aberración esférica cuando se utiliza un grosor no estándar de la cubierta de vidrio, muchos objetivos están equipados con un collar de corrección ajustable que puede configurarse con diversos parámetros de grosor. El collar de corrección opera traduciendo un grupo de lentes internas para modificar la longitud focal del objetivo. Incluso si se utiliza una cubierta de vidrio con el grosor adecuado, la presencia de una capa de medio de montaje entre el vidrio y la muestra se desvía de la situación óptica idónea, y aumentará el grado de aberración esférica. El collar de corrección también puede usarse para minimizar la aberración esférica inducida por los cambios en el índice de refracción de este tipo, los cuales en microscopía confocal provocan una reducción de la intensidad en el estenopo y una reducción de la discriminación de profundidad por los cambios de enfoque axial.

Los objetivos diseñados para la inmersión en aceite suelen estar optimizados para su uso con cubiertas de vidrio de 0,17 milímetros de grosor y un índice de refracción de 1,518 a las longitudes de onda especificadas, y un aceite de inmersión con un índice de refracción definido de forma precisa. La determinación de las condiciones operativas respecto de la cubierta de vidrio y el medio de inmersión, permite corregir la aberración esférica en el diseño del objetivo para varios valores de longitud de onda (dependiendo del tipo de objetivo). La importancia de combinar los índices de refracción entre cada material en toda la trayectoria de la luz, desde la muestra y el medio de montaje hasta el elemento de la lente frontal del objetivo, ha sido históricamente uno de los criterios más importantes para el procesamiento de imágenes, especialmente para alcanzar una alta resolución con muestras biológicas. El índice de refracción de los componentes subcelulares es considerablemente inferior al del medio de inmersión convencional, y en muchos casos estos índices de refracción son desconocidos y varían a lo largo de la muestra. Incluso en materiales fijos, el índice de refracción del medio de montaje suele no ser idéntico al de los aceites de inmersión disponibles.

Para las investigaciones de los procesos dinámicos en células vivas, que se cultivan y mantienen en solución salina fisiológica, la discrepancia en los índices de refracción del agua y el aceite genera una limitación crítica en el rendimiento de los objetivos de inmersión en aceite. El principal problema es que el potencial máximo de los objetivos de inmersión en aceite con la apertura numérica más alta no se consigue debido a la discrepancia entre el índice de refracción del agua (1,33) y el del aceite de inmersión (aproximadamente 1,5). Un factor crítico en la aplicación de la microscopía confocal es la mejora del procesamiento de imágenes por fluorescencia y la representación tridimensional de las muestras gruesas, y la aberración esférica introducida al usar los objetivos de inmersión en aceite con muestras acuosas limita la profundidad en el medio a la que pueden obtenerse imágenes aceptables. En general, los objetivos de inmersión en aceite de alta apertura numérica se han diseñado para ser usados en planos de imágenes a no más de 15-20 micrómetros debajo de la cubierta de vidrio. Sin embargo, cuando se aplica a muestras acuosas, la aberración esférica inducida en la interfaz entre el agua y la cubierta de vidrio puede llegar a niveles sustanciales a profundidades tan bajas como los 10 micrómetros. A modo de ejemplo, las funciones de dispersión de punto mostradas en la Figura 3 demuestran el aumento del grado de aberración esférica que se produce con un objetivo de inmersión en aceite de plano aprocromático a profundidades de penetración que van de cero a ocho micrómetros.

El interés en el uso de técnicas de fluorescencia confocal para recopilar datos tridimensionales de muestras biológicas acuosas fue un incentivo primordial para que los fabricantes de microscopios introdujeran una serie de objetivos de inmersión en agua con alta apertura numérica y alta corrección. Pero el agua presenta dos inconvenientes: se seca fácilmente por lo que no resulta práctica para el procesamiento de imágenes de lapso de tiempo prolongado, y tiene un índice de refracción bajo de 1,33 por lo que no puede usarse en el diseño de objetivos de alta apertura numérica. Por lo tanto, los fabricantes introdujeron los objetivos de inmersión en aceite para este fin, ya que su índice de refracción de 1,4 es cercano al índice de las células vivas y no se seca. La aberración esférica es una limitación óptica importante en los estudios confocales de células vivas cuando se utilizan objetivos de inmersión en aceite, y del aumento de los efectos en proporción a la profundidad de observación en los medios acuosos y los componentes subcelulares variables (consulte la Figura 3). Los efectos negativos en el procesamiento de imágenes incluyen una pérdida del contraste y la intensidad de la señal debido a la reducción en la fracción de intensidad de fluorescencia emitida que llega al estenopo del detector, la pérdida de resolución de las características de muestras diminutas y la reducción de precisión en la posición del eje z, que afecta a la integridad de las reconstrucciones de imágenes tridimensionales. La utilización de objetivos de inmersión en aceite de silicona para procesar imágenes de muestras en medios acuosos a una profundidad considerable debajo de la cubierta de vidrio permite evitar o minimizar la degradación de la aberración esférica, proporcionando todos los beneficios de la técnica confocal que va a realizarse. Los objetivos de inmersión en aceite de silicona con largas distancias de trabajo pueden recopilar datos tridimensionales precisos a profundidades superiores a 200 micrómetros en medios acuosos.

Un objetivo de inmersión en aceite, independientemente del grado de corrección óptica, no es la elección óptima para procesar imágenes de muestras sumergidas en aceite. Solo se puede conseguir una calidad de imagen óptima con esta combinación para regiones de la muestra que están en contacto directo con la cubierta de vidrio. A profundidades superiores, el efecto en la aberración esférica degrada el contraste y la resolución, y reduce el brillo hasta el punto que la relación entre ruido y señal confocal se reduce drásticamente. La solución óptima para minimizar la aberración esférica inducida al procesar imágenes a largas distancias en medios acuosos es la utilización de un objetivo de inmersión en aceite de silicona con corrección alta.

Una táctica usada para corregir la aberración esférica es implementar collares de corrección en los objetivos de inmersión en aceite de silicona y agua. Estos collares de ajuste proporcionan una corrección variable para la aberración esférica, como la inducida por las fluctuaciones en el grosor del vidrio. Este tipo de collar de corrección también resulta útil para compensar las diferencias del índice de refracción en medios fisiológicos y en los constituyentes de tejidos y células, así como para la variación del índice de refracción con los cambios en la temperatura o la concentración del soluto. Debido a la gran variedad de factores que pueden contribuir a la aberración esférica inducida, el ajuste de la corrección es una función muy útil en los objetivos para aplicaciones confocales incluso si se utiliza una cubierta de vidrio con un grosor óptimo.

Aberraciones ópticas fuera del eje

La aberración óptica más común conocida como coma afecta principalmente a las fuentes similares a un punto lejos del eje óptico, que producen una distorsión radial como una veta en los puntos de la imagen que aumentan en gravedad con el ángulo de campo (véase la Figura 4). El coma es parecido a la aberración esférica ya que ambos están inducidos potencialmente por los mismos factores. Esta aberración suele corregirse bien en los sistemas ópticos modernos mediante el uso de los elementos de la lente apropiados, y objetivos en los que el coma y la aberración esférica se eliminan y clasifican como aplanáticos. Dado que el coma es principalmente una aberración fuera del eje, es importante para los sistemas de barrido láser confocal, que suelen utilizar trayectorias del haz fuera del eje pero no es un factor con los microscopios confocales (dentro del eje) de barrido de muestras.

Varios tipos de aberración geométrica adicionales son potencialmente importantes para el rendimiento del objetivo confocal y, dado que todos los tipos son más evidentes en regiones del campo de imagen lejos del centro, tienen más probabilidad de afectar al rendimiento en sistemas confocales de barrido láser. La demanda óptica del procesamiento de imágenes confocal es tal que solo una óptica con alta corrección puede tener un rendimiento adecuado y las aberraciones geométricas significativas probablemente se minimizarán en objetivos de esta categoría. Con todo, se recomienda tener en cuenta estas aberraciones y los posibles problemas que pueden aparecer al escoger los objetivos, especialmente si las características de rendimiento específicas se sacrifican para optimizar otra variable que puede ser más importante en una aplicación específica.

El astigmatismo no corregido puede reducir la intensidad de imagen, la nitidez y el contraste, con efectos en aumento a una mayor distancia del eje óptico (Figura 4). La geometría de un punto de imagen astigmático puede definirse considerando dos planes ortogonales que son secciones transversales en la frente de onda de la imagen. Los planos (tangencial y sagital) en un sistema astigmático pueden tener distancias focales diferentes y mostrar un radio separado para un punto de muestra perfectamente simétrico. Esta aberración hace que las características simétricas similares a un punto que están localizadas fuera del eje se elonguen radial o tangencialmente en el plano de imagen, dependiendo del enfoque. Cuando se escoge el mejor enfoque en una posición comprometida entre dos extremos, el disco de Airy resultante no es simétrico y degrada la imagen. El astigmatismo puede deberse a elementos no centrados correctamente en un objetivo dañado o de baja calidad, y aumenta con otras faltas de alineación en la trayectoria óptica del microscopio.

Una propiedad de las lentes del objetivo descrita como curvatura de campo o planitud de campo es otro problema importante en el procesamiento de imágenes confocales para un campo más amplio de vista para el procesamiento de imágenes, especialmente de secciones de tejido. Las lentes esféricas simples enfocan los puntos de la imagen desde distintas regiones en una muestra plana en una superficie de imagen curvada, que refleja la forma de la superficie de la lente. Un plano de imagen plana no se adapta al plano curvado de enfoque, haciendo que las áreas central y periférica del campo no puedan enfocarse con nitidez de forma simultánea. Los diseños de lentes más complejos, formados por varios grupos de elementos de lentes, son necesarios para corregir esta curvatura de campo y para ampliar el tamaño de la zona central del enfoque nítido. Los objetivos diseñados como planos o de campo plano se corrigen ópticamente para producir un campo utilizable amplio con nitidez desde el centro hasta los bordes, con una curvatura de campo mínima en el plano de imagen intermedio. La planitud del campo en el plano de imagen final también depende de elementos ópticos intermedios, como los oculares del microscopio.

La falta de linealidad desde el centro hasta los bordes del campo de imagen produce distorsión geométrica de las características de la muestra, haciendo que los verdaderos perfiles dimensionales queden torcidos en la imagen. Si está presente, este efecto se observa fácilmente cuando se procesan imágenes de conjuntos ortogonales de líneas cruzadas, y en lugar de aparecer rectas en todo el campo de imagen, las líneas aparecen curvadas hacia fuera o hacia dentro en regiones alejadas del centro del campo. Estos dos tipos de distorsión suelen conocerse como distorsión de cilindro y cojín, respectivamente. Como en el caso de la curvatura de campo, las pequeñas cantidades de distorsión geométrica no suelen ser tan significativas en aplicaciones biológicas, pero pueden ser cruciales en investigaciones de ciencias de los materiales si se prevé realizar un análisis de defectos o mediciones precisas.

Aberraciones cromáticas

Las aberraciones cromáticas se deben a dos fenómenos ópticos fundamentales que muestran la dependencia de la longitud de onda y producen diversos tipos de defectos en la imagen. Un tipo de aberración cromática está provocada por el hecho de que los índices de refracción para todos los vidrios ópticos varían con la longitud de onda, mientras que el segundo se produce a causa de la variación en la magnificación con la longitud de onda. La dependencia del índice de refracción en la longitud de onda (normalmente conocida como dispersión) produce una diferencia de longitud-focal efectiva para la luz de longitudes de onda variables. En consecuencia, para una lente simple formada por una composición de vidrio único, solo puede enfocarse una longitud de onda (o un intervalo estrecho de longitudes de onda) de forma precisa en el plano de imagen con un ajuste de enfoque específico. Otras longitudes de onda se enfocarán más cerca o más lejos de la lente. La dispersión espectral resultante a lo largo del eje óptico se conoce como aberración cromática longitudinal o alternativamente aberración cromática axial (véase la Figura 5). Para una fuente similar a un punto visualizada en el eje óptico, la gradación en los índices de refracción hacen que una luz azul se enfoque más cerca de la lente, con las longitudes de onda más largas convergiendo en puntos focales progresivamente más lejos de la lente. La aberración, si no se corrige, puede visualizarse como franjas de color variables cuando la imagen se desenfoca en uno de los lados del mejor enfoque visual.

La aberración cromática longitudinal en un objetivo usado para la microscopía confocal puede tener efectos profundos, especialmente cuando se visualizan dos o más fluoróforos, que dependen de la capacidad de demostrar la colocalización de la emisión de fluorescencia en varias longitudes de onda. Cuando se utilizan varios fluoróforos, la aberración cromática longitudinal hace que los varios haces de excitación láser se enfoquen en distintos puntos de la muestra, con resultados similares en la recopilación de varias longitudes de onda de emisión desde puntos no coincidentes. Esta aberración niega la posibilidad de establecer posiciones precisas de los fluoróforos en la dirección z para generar los datos de la muestra en tres dimensiones.

En las técnicas de barrido confocal, la evaluación del efecto de las aberraciones cromáticas en la integridad de las imágenes para un objetivo específico requiere la consideración de todos los factores que determinan la energía de la señal que pasa por el estenopo y que registra el detector. Estos factores incluyen el espectro de emisión láser de excitación, el pico de emisión y el ancho de banda de cada fluoróforo, así como la sensibilidad espectral del detector. La corrección de la aberración cromática longitudinal suele conseguirse en el diseño del objetivo combinando varios elementos de lentes con características ópticas distintas, y el grado de corrección forma parte de la base para clasificar los objetivos en distintas categorías (como explicaremos más adelante).

El cambio en la longitud focal de la lente con la longitud de onda, que produce la dispersión axial que caracteriza la aberración cromática longitudinal, también es responsable de la ocurrencia de aberración cromática lateral (véase la Figura 5). Dado que la magnificación es inversamente proporcional a la longitud focal, la variación en la longitud focal con la longitud de onda produce una dependencia correspondiente de magnificación en la longitud de onda. Si esta aberración no se corrige en el objetivo, los bordes nítidos en la imagen pueden estar rodeados por franjas de color azul o rojo. La magnificación del componente de longitud de onda azul de la señal puede ser distinta de la del componente rojo en aproximadamente el 1-2% en objetivos no corregidos. Cuando está presente en un sistema óptico de barrido confocal, la aberración cromática lateral puede provocar una pérdida de señal en el estenopo, debido a la posibilidad de que la luz emitida se visualice en una posición que está más ceca o más lejos del eje óptico que la verdadera posición de la muestra, dependiendo de la composición espectral de la luz.

Dado que los dos tipos de aberración cromática están relacionados, los objetivos que tienen una corrección alta para la aberración cromática longitudinal suelen mostrar también una aberración cromática lateral mínima. Los fabricantes de microscopios adoptan distintos enfoques para corregir los diversos factores que afectan al rendimiento óptico, y es fundamental combinar correctamente los componentes del sistema para obtener una corrección máxima de las aberraciones. En la microscopía de fluorescencia confocal, la aberración cromática lateral no corregida genera problemas similares a los que la variedad longitudinal que introducen errores en el mapeo de ubicaciones de los fluoróforos emitidos en las distintas longitudes de onda.

Tradicionalmente los microscopios ópticos se fabricaban siguiendo una norma para el diseño del objetivo que exigía que el objetivo formase una imagen real a una distancia fija especificada desde la superficie de montaje del objetivo, que correspondía al plano focal frontal del ocular. Las configuraciones basadas en la formación directa de una imagen intermedia real por el objetivo se conocen como sistemas finitos, y la distancia hasta la imagen intermedia se conoce como longitud del tubo del objetivo. Aunque anteriormente los fabricantes estandarizaron sus sistemas ópticos finitos en la misma longitud del tubo y la misma distancia parfocal, se han adoptado distintos enfoques para compensar las aberraciones de la lente, y este factor debe considerarse si se utilizan componentes ópticos de los distintos fabricantes de forma combinada. Los sistemas finitos pueden diseñarse para proporcionar una corrección de la aberración completa en el objetivo, o puede permitirse un nivel residual conocido de aberración cromática lateral en la imagen formada por el objetivo, que se compensa por medio del ocular.

En el sistema óptico infinito, los rayos de luz que salen del objetivo no están enfocados sino que permanecen paralelos hasta que convergen en el plano de imagen intermedio por medio de una lente de tubo (ocasionalmente conocida como lente detelan). La mayoría de fabricantes de microscopios han creado sistemas ópticos de corrección infinita que tienen el beneficio intrínseco de que los rayos de luz procedentes del objetivo, enfocados en el infinito, son relativamente insensibles a los componentes ópticos adicionales colocados en el "espacio infinito" entre el objetivo y la lente del tubo. Aunque la lente del tubo puede realizar parte de la corrección para las aberraciones residuales, existen ventajas en la versatilidad de los diseños que proporcionan una corrección completa dentro del objetivo, con la lente del tubo siendo neutral a nivel óptico. En la Figura 6 podemos ver las trayectorias de luz infinitas para microscopios de fluorescencia invertidos y verticales típicos. La flecha de color blanco de doble aspa en cada diagrama de microscopio indica la trayectoria de luz paralela entre la apertura trasera del objetivo y la lente del tubo.

Los distintos fabricantes cumplen especificaciones de diseño diferentes para sus sistemas infinitos, como la longitud focal de la lente del tubo y la longitud del espacio infinito. Los sistemas ópticos de corrección infinita permiten mover el objetivo para el enfoque en lugar de la platina del microscopio. Esta capacidad constituye una ventaja muy importante en aplicaciones que requieren una manipulación delicada de la muestra durante la observación. Con todo, el principal beneficio práctico del espacio infinito es que los componentes ópticos auxiliares, como los analizadores de luz polarizada, los filtros y los prismas de contraste de interferencia diferencial (DIC), pueden añadirse sin preocuparse por sus propiedades de refracción ni por el grosor. Siempre que tengan superficies paralelas planas, los elementos añadidos tendrán un efecto insignificante en la calidad de imagen. Contrariamente, los componentes ópticos no pueden colocarse en la trayectoria del haz de un sistema de corrección infinita, que converge entre el objetivo y el plano de imagen intermedio, sin introducir desplazamiento de la imagen y otras aberraciones que varían con el grosor y el índice de refracción de los elementos añadidos.

Corrección óptica en objetivos de microscopios

Independientemente de si se utiliza un sistema óptico finito o con corrección infinita, los criterios de rendimiento combinados de los objetivos diseñados para el sistema deben tenerse en cuenta a la hora de determinar qué objetivos cumplirán los requisitos de una técnica de procesamiento de imágenes específica. Los objetivos suelen agruparse en categorías de rendimiento basadas en su grado de corrección óptica. Como hemos comentado anteriormente, la importancia relativa de las diversas aberraciones y los criterios de rendimiento afectados dependen de la manera en que se utiliza el objetivo y de los requisitos esenciales de la aplicación. La agrupación más general de los objetivos suele basarse en su grado de corrección de aberración cromática, aunque las categorías de objetivos tradicionales han pasado a ser menos distintivas en los últimos tiempos, debido en parte a los avances tecnológicos en la fabricación y el diseño de componentes ópticos. La mayor parte de la nomenclatura descriptiva sigue siendo válida y se utiliza ampliamente, y es importante entender los términos empleados y su pertenencia a las aplicaciones confocales a la hora de evaluar los distintos objetivos disponibles.

Las aberraciones cromáticas son el resultado de la dispersión en el vidrio óptico usado para fabricar una lente y suelen corregirse utilizando una combinación de elementos de lentes con propiedades de dispersión diferentes. Tradicionalmente, los objetivos con una corrección mínima para la aberración cromática se han categorizado como acromáticos (véase la Figura 7) y suelen construirse usando un vidrio con una dispersión "normal". Los vidrios de este tipo muestran una reducción casi lineal del índice de refracción con una mayor longitud de onda, e incluyen vidrios de pedernal y corona. El vidrio de corona suele mostrar un índice de refracción bajo y una dispersión baja contrariamente al vidrio de pedernal, que suele tener un índice de refracción alto y una alta dispersión. En los objetivos acromáticos anteriores, se combinaban dos o más elementos de lentes de estos tipos de vidrio para proporcionar una corrección de la aberración cromática que colocará la luz roja y azul en un enfoque común, y también corrige la aberración esférica para la luz verde. Los objetivos acromáticos modernos suelen tener una corrección adicional para la aberración esférica y una corrección considerable para la curvatura de campo. Si el objetivo se corrige para ampliar la planitud del campo en todo el campo de imagen recibe el nombre de plano acromático. En general, los objetivos acromáticos son adecuados para observación visual de campo claro convencional, y para fotomicrografía y procesamiento de imágenes digitales con la corrección (plano) adicional para la curvatura de campo.

Para que el objetivo consiga una corrección de aberración cromática mejorada, se necesitan tipos de vidrio que tengan una dispersión anómala sobre una sección del espectro. En vidrios que muestran un cambio no lineal del índice de refracción con la longitud de onda en la región espectral roja o azul, las aberraciones cromáticas también pueden compensarse para permitir un enfoque simultáneo de más de dos longitudes de onda. La fluorita cristalina fue uno de los primeros materiales encontrados para ofrecer propiedades ópticas adecuadas con el fin de reducir el espectro secundario no corregido responsable de las franjas verdes o moradas que limitan los bordes nítidos, que caracterizan las imágenes adquiridas con acromáticos. En combinación con varios vidrios ópticos, los elementos de fluorita proporcionan la capacidad de corregir las aberraciones en las lentes cromáticas para tres longitudes de onda (colores) y la aberración esférica para dos de ellas. Además, estos objetivos con alta corrección han mejorado las características de transmisión en la región espectral ultravioleta.

Algunos avances tecnológicos más recientes han ofrecido nuevas formulaciones del vidrio óptico y nuevas capacidades para definir la forma de la lente. Estos avances permiten producir propiedades de dispersión similares a las de los elementos de fluorita y la mayoría de fabricantes producen una línea de objetivos de flúor que tienen correcciones ópticas que se acercan a las de la categoría más alta (Figura 7). Estos objetivos algunas veces se conocen como semi aprocromáticos y pueden o no contener elementos de fluorita, pero debido a sus características ópticas son designados por muchos fabricantes con nombres como Fl y PlanFl. Los objetivos actuales en esta categoría están disponibles en muchas configuraciones, incluyendo modelos para uso con varios medios de inmersión que son adecuados para su uso en campo claro, fluorescencia, contraste de fase, luz polarizada y contraste de interferencia diferencial, así como algunas aplicaciones confocales y multifotón.

Los objetivos clasificados como apocromáticos son generalmente aquellos que tienen el nivel más alto de corrección para las aberraciones esféricas y cromáticas (véase la Figura 7). Estos objetivos suelen tener la apertura numérica más alta disponible para una magnificación específica, y tanto las aberraciones cromáticas como las esféricas se corrigen al menos para tres longitudes de onda. Con una corrección casi completa de las aberraciones, los objetivos apocromáticos suelen ser adecuados para cualquier técnica microscópica, aunque deben considerarse todos los requisitos específicos de rendimiento para la técnica empleada. A pesar del grado excepcional de corrección óptica mostrada por los apocromáticos, dado que utilizan el triple o el doble de elementos de lentes, algunas veces sacrifican otras especificaciones importantes como la apertura numérica o la planitud. Las nuevas técnicas de fabricación comercial han superado este compromiso a través de una novedosa tecnología de pulido de la lente que permite usar elementos de lentes ultra finos. La combinación de lentes cóncavas y convexas ultra finas permite a estos objetivos alcanzar una corrección de la aberración cromática y un nivel de transmitancia superior en el rango espectral de violeta a NIR, una apertura numérica más alta y una planitud ampliada.

Las aplicaciones de fluorescencia confocal pueden verse limitadas gravemente si las aberraciones del objetivo no se corrigen de forma similar para las longitudes de onda de emisión y excitación, un requisito que ahora es más complejo si se utilizan varios fluoróforos o cuando la diferencia entre las longitudes de onda de excitación y emisión es grande. Para alcanzar la energía fotónica máxima detectada, la parfocalidad entre el punto de iluminación y la región detectada visualizada en el estenopo deben mantenerse. Muchos objetivos, incluso en la clase apocromática, no ofrecen una corrección adecuada para las técnicas de fluorescencia combinando la excitación ultravioleta con la emisión de región visible. Pueden emplearse componentes ópticos adicionales en la fuente láser ultravioleta para compensar el fallo del objetivo y adaptarse a un mayor abanico de longitudes de onda, aunque ello añade costes y una complejidad operativa considerable al sistema confocal.

Los objetivos de inmersión en agua de alto rendimiento y los objetivos de inmersión en aceite de silicona se han diseñado específicamente para satisfacer los requisitos impuestos por las áreas de investigación de procesamiento de imágenes de células vivas. Un objetivo principal sería lograr un rendimiento óptimo en la microscopía de fluorescencia confocal de muestras biológicas, tanto en células vivas como en tejidos en suero fisiológico. Es esencial reconocer que, independientemente del nivel de corrección de aberración incorporado en el diseño del objetivo, pueden introducirse aberraciones adicionales en la trayectoria óptica fuera del objetivo infringiendo los requisitos operativos de diseño, y estas pueden degradar el rendimiento de los mejores componentes.

Los objetivos diseñados para la inmersión directa o remojo en agua, que cuentan con conos de cerámica o polímero, están disponibles para los estudios fisiológicos y de células vivas. Estas investigaciones suelen requerir acceso a la muestra para realizar mediciones u otras manipulaciones, y no pueden realizarse con una cubierta de vidrio colocada. Por lo general, los objetivos de inmersión en agua están incluidos en la categoría de fluoritas, tienen una alta transmisión en las regiones espectrales ultravioleta e infrarrroja, y se han diseñado con especificaciones de larga distancia de trabajo y un perfil estrecho de inserción (inmersión) en el cono del objetivo. El cono angular más pequeño del objetivo está indicado para permitir un acceso máximo a la muestra para la conexión de microelectrodos o para realizar otras operaciones durante la observación. Las largas distancias de trabajo, que pueden ser de varios milímetros con algunos objetivos de este estilo, también ofrecen un buen acceso a la muestra. La sección de inmersión de muchos objetivos de inmersión está fabricada con cerámica u otro material aislante inerte que ofrece aislamiento eléctrico y resistencia química. Su combinación de características hace que los objetivos de inmersión en agua sean adecuados para muestras vivas confocales, multifotón y otras metodologías de procesamiento de imágenes.

Además de la magnificación, la apertura numérica y el grado de corrección óptica, la distancia de trabajo del objetivo tiene una importancia especial en microscopía confocal y otras técnicas de microscopio digital usadas para adquirir información sobre la muestra en tres dimensiones. La distancia de trabajo, para un objetivo que necesita una cubierta de vidrio, se define como la distancia entre la superficie superior de la cubierta de vidrio y el elemento de la lente frontal con una muestra plana en contacto con la cubierta de vidrio enfocada (Figura 9(b)). Esta distancia es importante cuando el procesamiento de imágenes confocales se realiza en varias profundidades en la muestra, ya que determina la profundidad de penetración focal máxima que puede conseguirse antes de que el objetivo entre en contacto con la parte superior de la cubierta de vidrio. Por lo tanto, la distancia de trabajo limita el intervalo a lo largo del eje z para recopilar los datos de la muestra.

Como ejemplo, un objetivo con una distancia de trabajo de 0,20-milímetros (200 micrómetros) puede enfocarse hasta una profundidad máxima de 200 micrómetros por debajo de la cubierta de vidrio antes de que el objetivo toque la superficie superior de la cubierta de vidrio. Dentro de los límites, la distancia de trabajo puede modificarse en el diseño óptico, aunque suele reducirse al tiempo que se aumenta la magnificación, la apertura numérica y la corrección óptica. El mantenimiento de una apertura numérica grande y un alto grado de corrección de la aberración con una distancia de trabajo larga está restringido por las limitaciones geométricas simples impuestas por la forma de los elementos de la lente y el número necesario en un objetivo con alta corrección. Las especificaciones de muchos objetivos disponibles actualmente representan logros remarcables en el rendimiento gracias a la disponibilidad de vidrios ópticos, revestimientos de lentes y funciones de diseño informático mejorados.

El hecho de que la intensidad de la señal es proporcional al cuadrado de la apertura numérica tiene implicaciones en la elección de los objetivos óptimos para la microscopía confocal y en algunas ocasiones altera la importancia relativa de los diversos factores de rendimiento. Cuando se utilizan sistemas de barrido confocal con una función de zoom de escaneo, pocas veces es necesario emplear una magnificación óptica de 100x, y los objetivos de 40X y 60X de alta apertura numérica y alta corrección pueden ser más adecuados. Pueden adquirir imágenes de campo visual ampliado usando un zoom de escaneo inferior e imágenes de estructura subcelular en alta resolución con un zoom de escaneo superior.

Muchas técnicas populares, como el procesamiento de imágenes de inmunofluorescencia, sufren intrínsecamente esos niveles de luz bajos que son de especial importancia para las propiedades de transmisión del sistema óptico. Solo pueden estar disponibles unos pocos fotones para la detección de los detalles más diminutos de la muestra y como consecuencia de una diferencia relativamente menor en el porcentaje de transmisión en la longitud de onda de la emisión o excitación de fluoróforos, pueden ser cruciales a la hora de determinar la detectabilidad de una característica marcada. En algunas situaciones, las propiedades de transmisión del objetivo pueden ser más importantes que otras especificaciones como la planitud del campo o la corrección de aberración, que requieren elementos de lentes adicionales y revestimientos que pueden aumentar la pérdida de iluminación en una banda crítica de la longitud de onda. Sin embargo, los avances en la tecnología óptica evitan este compromiso de trasmitancia a través de una tecnología exclusiva de fabricación de la lente.

El número de técnicas especializadas aplicadas a los problemas en la biología molecular y celular, así como en otros campos, ha generado cambios en las demandas impuestas en los sistemas de procesamiento de imágenes ópticas, especialmente en lo tocante al objetivo del microscopio. El aumento dramático del uso de las técnicas de barrido confocal para investigaciones en tres dimensiones de muestras biológicas ha generado una gran influencia en los productos que se han desarrollado a nivel comercial, aunque otros métodos como la captura láser, la excitación multifotón, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) y el contraste de interferencia diferencial de infrarrojos también ha impuesto nuevos requisitos. Una serie de parámetros para técnicas especializadas han demostrado que algunos criterios de rendimiento de los objetivos tradicionales pueden sacrificarse, al menos parcialmente, para mejorar otras especificaciones más críticas. Los increíbles avances en el diseño de lentes asistido por ordenador y las formulaciones de vidrio óptico, además de la tecnología de revestimientos antirreflejo, han permitido introducir componentes ópticos mejorados que pueden cumplir todos los nuevos requisitos, con ninguna o pocas concesiones en la microscopía de campo amplio convencional. Algunos ejemplos serían los objetivos de inmersión en aceite de silicona de alto rendimiento con una apertura numérica más alta, una distancia de trabajo aumentada, collares de corrección con aberración esférica y objetivos con transmisión ultravioleta e infrarroja mejorada. Además, los objetivos fabricados con lentes ultra finas permiten a los investigadores conseguir una alta apertura numérica, una alta transmitancia, una corrección de la aberración cromática de un rango espectral más amplio y una planitud ampliada sin comprometer ninguna de estas especificaciones.

Muchos objetivos modernos son adecuados para la microscopía confocal cuando se utilizan conforme a sus especificaciones de diseño. El examen en alta resolución y el procesamiento de imágenes preciso en tres dimensiones para muestras acuosas espesas con un microscopio confocal de barrido láser es especialmente complejo y requiere un objetivo que satisfaga todos los criterios siguientes: alta apertura numérica para recopilación de fluorescencia eficiente, larga distancia e trabajo para permitir una penetración máxima, campo plano para una reconstrucción tridimensional precisa, aberración cromática axial baja para parfocalidad de varios fluoróforos y aberración cromática lateral baja para permitir un registro preciso de varias imágenes de fluorescencia, además de una alta transmisión en las longitudes de onda de excitación y emisión.