Objetivos de microscopios: Introducción

Los objetivos microscópicos (u objetivos de microscopios) son quizás los componentes más importantes de un microscopio óptico, ya que son responsables de la formación de imágenes primarias y desempeñan un papel primordial a la hora de determinar la calidad de las imágenes que puede producir el microscopio. Los objetivos también son prácticos a la hora de determinar la magnificación de una muestra concreta y la resolución con la que puede observarse un detalle diminuto a partir de una muestra bajo el microscopio.

El objetivo es el componente más complejo de un microscopio óptico en cuanto a diseñar y montar; y, es el primer componente que entra en contacto con la luz cuando ésta se desplaza desde la muestra hasta el plano de imagen. La nomenclatura de los objetivos deriva del hecho que son, por proximidad, el componente más cercano al objeto (muestra) que se va a procesar en imagen.

Los grandes fabricantes de microscopios comercializan una amplia gama de diseños de objetivos, que presentan excelentes características ópticas en un amplio espectro de condiciones de iluminación y ofrecen varios grados de corrección para las aberraciones ópticas primarias. El objetivo ilustrado en la Figura 1 es un objetivo apocromático de 250x con larga distancia de trabajo que contiene 14 elementos ópticos consolidados entre sí a través de tres grupos de parejas de lentes, un grupo de tres lentes y tres lentes individuales de un solo elemento interno. El objetivo tiene también una lente frontal hemisférica y una segunda lente de menisco que funciona en sincronía para poder capturar los rayos de luz con una apertura numérica elevada y una aberración esférica mínima. Si bien la siguiente característica no está presente en este objetivo, muchos objetivos de alta magnificación y diseño similar vienen equipados con un ensamblaje de cono retráctil que protege los elementos de la lente frontal y la muestra de daños por colisión. Los elementos internos de la lente se orientan con cuidado y están bien fijos a un recinto tubular de bronce, encapsulado por el cilindro del objetivo. Los parámetros específicos del objetivo, como la apertura numérica, la magnificación, la longitud del tubo óptico, el grado de corrección de la aberración y otras características importantes, se encuentran impresos o grabados en la parte externa del cilindro. Si bien el objetivo ilustrado en la Figura 1 ha sido diseñado para funcionar con aire como medio de adquisición de imágenes entre la lente frontal del objetivo y la muestra, otros objetivos presentan elementos de lente frontal que les permiten estar sumergidos en agua, glicerina o aceite especializado basado en hidrocarburos.

Los objetivos modernos, compuestos por numerosos elementos de lentes de vidrio internos, han alcanzado un elevado nivel de calidad y rendimiento, en el que el grado de corrección de las aberraciones y la planitud de campo determina la utilidad y el costo(e) del objetivo. Las técnicas y los materiales de construcción utilizados para fabricar objetivos han mejorado considerablemente durante los últimos 100 años. En la actualidad, los objetivos se diseñan mediante sistemas de diseño asistido por computadora (CAD) usando fórmulas de vidrio avanzadas de elementos raros, dotadas de composición y calidad uniformes, con índices de refracción muy específicos. La mejora a nivel del rendimiento, demostrada al usar estas técnicas avanzadas, ha permitido que los fabricantes produzcan objetivos con dispersión muy baja y corrección para la mayoría de los artefactos ópticos frecuentes, como coma, astigmatismo, distorsión geométrica, curvatura de campo y aberración esférica y cromática. Ahora no solo son objetivos microscópicos corregidos para más aberraciones dentro de campos más amplios, sino que se ha disminuido el resplandor en la imagen drásticamente y se ha incrementado sustancialmente la transmisión de la luz, lo que tiene como consecuencia que las imágenes sean sorprendentemente brillantes, nítidas y claras.

Existen tres características cruciales en el diseño del objetivo que definen el límite máximo de resolución del microscopio. Estas son la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra, la apertura angular del cono de luz capturado por el objetivo y el índice de refracción en el espacio del objeto entre la lente frontal del objetivo y la muestra. La resolución de un microscopio óptico con difracción limitada puede describirse como la distancia mínima detectable entre dos puntos de la muestra menos distanciados:

R = λ / 2n(sin(θ))

donde R es la distancia de la separación, λ es la longitud de onda de la iluminación, n es el índice de refracción del medio de adquisición de imágenes y θ es la mitad de la abertura angular del objetivo. Al examinar la fórmula, se evidencia que la resolución es directamente proporcional a la longitud de onda de la iluminación. El ojo humano responde a la región de la longitud de onda de entre 400 y 700 nanómetros, que representa el espectro de luz visible usado en la mayoría de observaciones microscópicas. La resolución también depende del índice de refracción del medio de procesamiento de imágenes y la apertura angular del objetivo. Los objetivos se han diseñado para capturar imágenes de muestras a través de un medio —aire u otro— dotado de un índice de refracción superior entre la lente frontal y la muestra. Es frecuente que el campo visual sea bastante limitado; el elemento de la lente frontal del objetivo se coloca cerca de la muestra con el que debe estar en contacto óptico. Se alcanza una ganancia en resolución por factor de 1,5 cuando el aceite de inmersión es sustituido por aire como medio de procesamiento de imágenes.

El último factor, y quizá el más importante, para determinar la resolución de un objetivo es la apertura angular, que tiene un límite superior práctico de casi 72° (con un valor del seno de 0,95). Al ser combinado con el índice de refracción, el producto

n(sin(θ))

es conocido como la apertura numérica (A. N., o NA por sus siglas en inglés) y ofrece un indicador coherente con respecto a la resolución de cualquier objetivo concreto. La apertura numérica suele ser el criterio de diseño más importante (aparte de la corrección óptica) que ha de tenerse en cuenta cuando se selecciona un objetivo de microscopio. La escala de valores va de 0,1 para objetivos con magnificación muy baja (de 1x a 4x) a 1,6 para objetivos de alto rendimiento que utilizan aceites de inmersión especializados. Dado que los valores de apertura numérica aumentan a través de una serie de objetivos con la misma magnificación, por lo general, se observa una mayor capacidad de recuperación de la luz y aumento en la resolución. El microscopista debe seleccionar con cuidado la magnificación del objetivo para que, en las mejores circunstancias, el detalle que se acaba de resolver se amplíe lo suficiente para verlo cómodamente, pero no hasta el punto en el que la magnificación vacía dificulte la observación de los detalles finos de la muestra.

De la misma forma que la claridad de iluminación de un microscopio es regulada por el cuadrado de la apertura numérica de trabajo del condensador, la claridad de una imagen producida por el objetivo la determina el cuadrado de su apertura numérica. Además, la magnificación del objetivo también desempeña un papel a la hora de determinar la luminosidad de la imagen, que es inversamente proporcional al cuadrado de la magnificación lateral. El cuadrado de la apertura numérica/índice de magnificación expresa la potencia de captación de luz del objetivo cuando se usa con la iluminación transmitida. Los objetivos de apertura numérica elevada suelen presentar una mejor corrección de aberración, por consiguiente, también recuperan más luz y producen una imagen más luminosa y corregida que se resuelve grandemente. Se debe tener en cuenta que la claridad de la imagen disminuye con rapidez a medida que se incrementa la magnificación. En los casos en los que el nivel de luz es un factor limitante, seleccione un objetivo con la más alta apertura numérica, pero que cuente con el factor de magnificación más baja para brindar una resolución adecuada.

Los objetivos más económicos (y los más frecuentes) empleados en la mayoría de microscopios de laboratorio son los objetivos acromáticos. Estos objetivos están corregidos en función de la aberración cromática axial a partir de dos longitudes de onda (azul y rojo; aproximadamente 486 y 656 nanómetros, respectivamente) que se reúnen en un único punto focal común. Asimismo, los objetivos acromáticos están corregidos en función de la aberración esférica de color verde (546 nanómetros; ver la Tabla 1). La corrección limitada de los objetivos acromáticos puede causar artefactos considerables cuando las muestras se examinan y se digitalizan con microscopía cromática y fotomicrografía. Si se elige el enfoque en la región verde del espectro, las imágenes tendrán un halo de color magenta rojizo (con frecuencia se denomina color residual). Los objetivos acromáticos alcanzan sus mejores resultados cuando la luz atraviesa un filtro verde (con frecuencia un filtro de interferencia), y cuando se usa una película negra y blanca al momento de usar estos objetivos en la fotomicrografía. La ausencia de corrección en la planitud de campo (o curvatura de campo) dificulta los resultados de los objetivos acromáticos. En los últimos años, la mayoría de los fabricantes ha comenzado a proporcionar correcciones de campo plano para objetivos acromáticos, y han denominado a estos objetivos corregidos planacromáticos.

El siguiente nivel de corrección y precios abarca los objetivos denominados objetivos de fluorita o semiapocromáticos (ilustrados por el objetivo central de la Figura 2). La denominación fluorita proviene del mineral que era usado originalmente para su construcción. En la Figura 2 se describen las tres clases principales de objetivos: Los objetivos acromáticos, que presentan una menor corrección como ya descrita anteriormente. Los objetivos semiapocromáticos (o de fluorita) que tienen correcciones esféricas adicionales; y los objetivos apocromátricos, que son los objetivos con mayor corrección. El objetivo posicionado más a la izquierda en la Figura 2 es un acromático de 10x, y contiene dos dobletes internos y un elemento de lente frontal. En medio de la Figura 2 se ilustra un objetivo de fluorita de 10x con varios grupos de lentes, incluidos dos dobletes y triplete, además de una lente frontal hemisférica y una lente de menisco secundaria. A la derecha de la Figura 2 hay un objetivo apocromático de 10x que también contiene grupos de lentes múltiples y elementos individuales. Si bien la construcción es similar a la de los objetivos de fluorita, las lentes tienen diferentes curvaturas y grosores; además, están dispuestas en una configuración única entre los objetivos apocromáticos.

Corrección de la aberración óptica del objetivo

Tabla 1

Al ensamblar el objetivo, las lentes deben ser ubicadas formando un distanciamiento estratégico; se fijan solapadas en soportes de celdas, después se empaquetan en un cilindro hueco central que va a montarse en el interior del cilindro del objetivo. Las lentes individuales se acomodan sobre un soporte de latón, para que la lente gire en un mandril de precisión de tornos y pueda ser pulida con un fino aro de metal que fija la lente (o grupo de lentes) a su lugar. La aberración esférica se corrige al seleccionar el conjunto óptimo de distanciadores entre los dos soportes inferiores de las lentes (la lente hemisférica y la lente de menisco). El objetivo deviene parfocal al trasladar el entero conglomerado de la lente hacia arriba o hacia abajo dentro del cilindro mediante tuercas de fijación; de este modo, los objetivos alojados en un portaobjetivos múltiple pueden intercambiarse sin perder enfoque. El ajuste de coma se efectúa mediante tres tornillos de centrado que permiten optimizar la posición de los grupos de lentes internas con respecto al eje óptico del objetivo.

Los objetivos de fluorita se producen a partir de preparaciones avanzadas de vidrio que contienen materiales como la fluorita o sustitutivos sintéticos novedosos. Estas nuevas formulaciones permiten mejorar en gran medida la corrección de la aberración óptica. De forma similar a los objetivos acromáticos, los objetivos de fluorita también se corrigen en términos cromáticos a nivel de la luz roja y azul. Por otra parte, los objetivos de fluorita también pueden corregirse de modo esférico para dos o tres colores, en lugar de uno sólo, como ocurre con los objetivos acromáticos. La corrección superior de los objetivos de fluorita en comparación con aquellos acromáticos permite que estos objetivos se fabriquen con una apertura numérica superior, lo que tiene como consecuencia imágenes más luminosas. Los objetivos de fluorita también poseen un mejor potencial de resolución que aquellos acromáticos, además de un nivel superior de contraste; por tanto resultan más adecuados que los acromáticos en la fotomicrografía a color con luz blanca.

El nivel superior de corrección (y costo[e]) se da en los objetivos apocromáticos, ilustrados en las Figuras 2 y 3. Los objetivos apocromáticos son las lentes microscópicas con el más alto nivel de corrección actualmente disponibles; cabe destacar que su elevado precio refleja el sofisticado diseño y el ensamble a conciencia que se requiere para su producción. En la Figura 3, se ilustra la comparación de los elementos de lentes en una serie de objetivos apocromáticos con una magnificación de 10x a 100x. Los objetivos apocromáticos de menor potencia (10x y 20x) se dotan de una distancia de trabajo más larga y la longitud total del objetivo es más corta que la de los objetivos apocromáticos de mayor potencia (40x y 100x). Es común ver objetivos apocromáticos corregidos cromáticamente para tres colores (rojo, verde y azul), lo que elimina prácticamente la aberración cromática, además se corrigen esféricamente en relación con dos o tres longitudes de onda (ver Tabla 1). Los objetivos apocromáticos son la mejor opción para la fotomicrografía en color con luz blanca. Debido a su elevado nivel de corrección, los objetivos apocromáticos suelen presentar aperturas numéricas superiores para una determinada magnificación a diferencia de los objetivos acromáticos o aquellos de fluorita. Varios de los nuevos objetivos de fluorita y apocromáticos de alto rendimiento están corregidos cromáticamente para cuatro (azul oscuro, azul, verde y rojo) o más colores y, esféricamente, para cuatro colores.

Los tres tipos de objetivos están sujetos a una desventaja: una curvatura de campo pronunciada. Esto conlleva a una proyección de imágenes curvas en lugar de planas: un artefacto cuya gravedad se incrementa cuando la magnificación es superior. Con el fin de solucionar esta condición inherente generada por las superficies curvas de la lente, los diseñadores ópticos han creado objetivos corregidos de campo plano, cuya producción de imágenes se mantiene en un enfoque común a través de todo el campo visual. Los objetivos que presentan la corrección de campo plano y de baja distorsión se denominan planacromáticos, planfluoritas o planapocromáticos en función del grado de aberración residual. Si bien dicha corrección es cara, también es bastante útil en el procesamiento de imágenes digital y la fotomicrografía convencional.

La curvatura de campo no corregida es la peor aberración óptica que se produce en los objetivos de fluorita (semiapocromáticos) y apocromáticos; ha sido tolerada como un artefacto inevitable durante muchos años. Al usarla rutinariamente, se debería determinar constantemente el enfoque en el campo visual —entre el centro y los bordes— para captar todos los detalles de la muestra. La introducción de una corrección de campo plano (plana) en los objetivos alcanzó un perfeccionamiento de uso a través de la fotomicrografía y videomicroscopía, y en la actualidad estas correcciones se han convertido en el estándar de los objetivos de uso general y los de alto rendimiento. La corrección de la curvatura de campo adiciona un número considerable de elementos de lente en el objetivo, tal como se ilustra en la Figura 4 con un objetivo acromático simple. El objetivo acromático no corregido, que aparece a la izquierda en la Figura 4, contiene dos lentes de dobletes, además de un elemento frontal sencillo de lente fina. Por el contrario, el objetivo planacromático corregido a la derecha de la Figura 4 contiene tres lentes de dobletes, un grupo central de lente de triplete y una lente de menisco ubicada detrás de la lente frontal hemisférica. En este ejemplo, la corrección plana ha causado la adición de seis elementos de lentes unidas en los más sofisticados grupos de lentes, lo que aumenta drásticamente la complejidad óptica del objetivo. El aumento considerable de elementos de lentes para la corrección plana también se produce en los objetivos de fluorita y los apocromáticos; esto frecuentemente tiene como consecuencia un encaje extremadamente estrecho de los elementos de la lente (Figura 1) dentro del cilindro del objetivo. En general, los objetivos de campo plano con curvatura de campo corregida se privan de una considerable distancia de trabajo, y muchas de las versiones con magnificación elevada cuentan con una lente frontal cóncava que puede resultar extremadamente compleja de limpiar y mantener.

Los objetivos más antiguos suelen tener aperturas numéricas inferiores y están sujetos a una aberración denominada «diferencia cromática de la magnificación» que requiere una corrección mediante oculares de compensación especialmente diseñados. Este tipo de corrección fue dominante durante el apogeo de los microscopios finitos (o de longitud de tubo fija), pero no es necesaria con los objetivos y microscopios modernos con corrección al infinito. En los últimos años, los objetivos microscópicos modernos ya integran la corrección de la diferencia cromática de la magnificación, ya sea a nivel del propio objetivo (Olympus y Nikon) o de la lente del tubo (Leica y Zeiss).

La imagen intermedia en un sistema con corrección al infinito aparece en la longitud focal de referencia (anteriormente, la longitud del tubo óptico) detrás de la lente del tubo en la trayectoria óptica. Esta longitud varía entre 160 y 250 milímetros en función de las restricciones de diseño impuestas por el fabricante. La magnificación de un objetivo con corrección al infinito se calcula dividiendo la longitud focal de referencia entre la longitud focal de la lente del objetivo.

En la mayoría de las aplicaciones biológicas y petrográficas, se usa un cubreobjetos para montar la muestra, con el fin de proteger tanto la integridad de la muestra como para ofrecer una ventana clara a la observación. El cubreobjetos no solo converge los conos de luz que se originan desde cada punto de la muestra, sino que además introduce la aberración cromática y esférica (y la consecuente pérdida de contraste) que debe ser corregida por el objetivo. El grado de conversión de los rayos de luz se determina mediante el índice de refracción, la dispersión y el espesor del cubreobjetos. Si bien el índice de refracción debería ser relativamente constante dentro de un lote de cubreobjetos, el espesor puede variar entre 0,13 y 0,22 milímetros. Otra preocupación es el disolvente acuoso o el exceso del medio de montaje que se encuentra entre la muestra y el cubreobjetos en preparaciones montadas húmedas o con un espesor grueso. Por ejemplo, en una solución salina fisiológica, cuyo índice de refracción es considerablemente diferente al índice de refracción del cubreobjetos, el objetivo debe poner el foco a través de una capa de agua de unas cuantas micras de grosor, lo que causa aberraciones considerables y una desviación de la función de distribución de puntos que ya no es simétrica por encima ni por debajo del plano focal. Estos factores contribuyen a las variaciones efectivas del índice de refracción y al espesor del cubreobjetos, lo que resulta muy complicado de controlar por el microscopista.

El medio de digitalización de imágenes entre la lente frontal del objetivo y el cubreobjetos de la muestra es también muy importante con respecto a la corrección de la aberración esférica y la coma en el diseño de los elementos de lente para los objetivos. Los objetivos de potencia más baja presentan aperturas numéricas relativamente inferiores y han sido diseñados para un uso en seco, cuyo medio para la digitalización de imágenes es solo aire entre la lente frontal del objetivo y el cubreobjetos. La apertura numérica teórica máxima que puede obtenerse con aire es 1,0; sin embargo, en la práctica es casi imposible tener un objetivo seco con una apertura numérica superior a 0,95. El efecto de la variación por el espesor del cubreobjetos es insignificante para objetivos secos que presentan aperturas numéricas inferiores a 0,4; sin embargo, esta desviación llega a ser significativa en aperturas numéricas superiores a 0,65, donde las fluctuaciones de tan solo 0,01 milímetros pueden generar una aberración esférica. Esto plantea problemas al usar objetivos apocromáticos de alta potencia, que deben aplicar distancias de trabajo muy cortas en aire e integran correcciones sensibles a la aberración esférica, las cuales tienden a complicar la obtención de imágenes nítidas.

Para remediarlo, muchos objetivos secos apocromáticos de alto rendimiento cuentan con collares de corrección. Estos están permiten ajustar y corregir la aberración esférica mediante la corrección de las variaciones a nivel del espesor de los cubreobjetos (Figura 5). La corrección óptica de la aberración esférica se efectúa girando el collar, lo que causa que dos de los grupos de elementos de lente en el objetivo se acerquen o se alejen. El collar de corrección del objetivo situado a la izquierda en la Figura 5 presenta un ajuste en función del espesor del cubreobjetos (0,20 mm), lo conlleva a que los elementos de lente ajustables se acerquen entre sí. En cambio, los elementos de lente ajustables —del objetivo situado a la derecha en la Figura 5— presentan una distancia de separación más grande para compensar cubreobjetos muy finos (0,13 mm). Una mayoría de los objetivos con collar de corrección, diseñados para la microscopía de luz transmitida vertical, tienen un rango de ajuste para variaciones basadas en el espesor de los cubreobjetos de entre 0,10 y 0,23 milímetros. Muchos de los objetivos de contraste de fase especialmente diseñados para observar muestras de cultivo tisular con un microscopio invertido tienen incluso un rango de compensación más amplio de 0 a 2 milímetros. Esto permite que las muestras se visualicen a través de la parte inferior de la mayoría de los recipientes de cultivo, los cuales pueden producir fluctuaciones drásticas a nivel del espesor en este rango de tamaños. Las muestras no cubiertas, como los frotis de sangre, pueden observarse con objetivos dotados de collares de corrección cuando el ajuste se establezca en 0, a fin de compensar la ausencia de un cubreobjetos.

Los objetivos secos de elevada apertura numérica que carecen de collar de corrección suelen producir imágenes que son inferiores a las de aquellos objetivos dotados de una apertura numérica inferior en los que el espesor del cubreobjetos no reviste tanta importancia. Por este motivo, suele ser prudente seleccionar un objetivo con una magnificación inferior (y apertura numérica) con el fin de obtener un contraste superior sin los artefactos complementarios introducidos por las fluctuaciones del cubreobjetos. Como ejemplo, un objetivo de 40x tiene una apertura numérica de 0,65 puede producir mejores imágenes con un contraste más nítido y una claridad que con un objetivo de 60x de apertura numérica de 0,85, aunque el poder de resolución del objetivo con mayor magnificación sea teóricamente superior.

El espesor estándar de los cubreobjetos es de 0,17 milímetros, lo cual se designa como cubreobjetos del número 1½. Desafortunadamente, no todos los cubreobjetos de 1½ se fabrican con esta limitada tolerancia; pueden abarcar desde 0,16 hasta 0,19 milímetros; y, muchas muestras tienen medios entre ellos y el cubreobjetos. La compensación del espesor del cubreobjetos puede lograrse al ajustar la longitud del tubo mecánico del microscopio o (como mencionado anteriormente) por medio de los collares de corrección especializados que cambian el espacio entre los elementos críticos dentro del cilindro del objetivo. El collar de corrección sirve para ajustar estas sutiles diferencias y garantizar el rendimiento óptimo del objetivo. La utilización adecuada de las lentes de objetivo con collares de corrección exige que el microscopista tenga suficiente experiencia y esté alerta para restablecer el collar usando los criterios adecuados de la imagen. En la mayoría de los casos, el enfoque puede desplazarse y la imagen puede desviarse durante el ajuste del collar de corrección. Siga los pasos a continuación para hacer pequeños ajustes incrementales en el collar de corrección de un objetivo mientras observa los cambios en la imagen de su muestra.

• Posicione el collar de corrección de modo a que la marca del indicador en el cilindro del objetivo coincida con la marca de escala de 0,17 milímetros grabada en la carcasa del collar.
• Coloque una muestra en la platina y enfoque el microscopio en una función de muestra pequeña.
• Gire el collar de corrección con la máxima delicadeza y vuelva a enfocar el objetivo para determinar si la imagen ha mejorado o empeorado. Dado que la mayoría de preparaciones de muestras quedan encajonadas entre los cubreobjetos y medios demasiado gruesos, inicie el experimento de rotación probando primero valores de compensación superiores (de 0,18 a 0,23).
• Repita el paso anterior para determinar si la imagen está mejorando o empeorando, ya que el collar de corrección está girando en una única dirección.
• Si la imagen ha empeorado, siga los mismos pasos y gire el collar de corrección en la dirección opuesta (hacia los valores inferiores) para encontrar la posición que ofrece una resolución y contraste óptimos.

La apertura numérica del objetivo puede aumentar drásticamente al destinar el objetivo a un uso con un medio de inmersión, como el aceite, la glicerina o el agua. Si se usa un medio de inmersión con un índice de refracción similar al del cubreobjetos de vidrio, prácticamente desaparece la degradación de imagen que se genera por las variaciones a nivel del espesor del cubreobjetos; esto hace que los rayos con oblicuidad ancha no sufran una refracción y sean captados con mayor facilidad por el objetivo. Los aceites de inmersión comunes tienen un índice de refracción de 1,51 y una dispersión similar a la de los cubreobjetos de vidrio. Los rayos de luz que atraviesan la muestra encuentran un medio homogéneo entre el cubreobjetos y el aceite de inmersión y no se refractan cuando entran en la lente, pero sí cuando salen de su superficie superior. El efecto que deriva de una muestra colocada en el punto aplanático (tanto en el punto focal como en el centro del campo), perteneciente a la primera lente de objetivo, es un procesamiento de imágenes llevado por esta parte del sistema de lente, exento por completo de aberración esférica.

El diseño general de un práctico objetivo de inmersión en aceite incluye un elemento de lente frontal hemisférico, seguido por una lente de menisco positiva y un grupo de lentes dobletes. En la Figura 6 se presentan las refracciones aplanáticas que se producen en los dos primeros elementos de la lente en un objetivo apocromático típico de inmersión en aceite. La muestra queda encajonada entre el portaobjetos y el cubreobjetos del microscopio en el punto P: el punto aplanático del elemento de la lente hemisférica. Los rayos de luz refractados desde la parte posterior de la lente hemisférica parecen proceder del punto P(1), que también es el centro de curvatura de la primera superficie de la lente de menisco. Los rayos de luz refractados entran en la lente de menisco a lo largo del radio de la primera superficie y no se produce refracción en dicha superficie. En la parte posterior de la lente de menisco, los rayos de luz se refractan aplanáticamente, de modo que parecen divergir del punto P(2). La refracción de los rayos de luz a partir de las superficies de los grupos de lentes posteriores en el objetivo completan la convergencia de los rayos de luz originada en el punto P, para formar así la imagen intermedia.

Las lentes de objetivo de inmersión en aceite, diseñadas correctamente, también corrigen los defectos cromáticos provocados por los dos primeros elementos de lente, a la vez que una mínima cantidad de aberración esférica entra. El hecho de que el cono de luz converge parcialmente antes de entrar en el primer elemento de la lente ayuda a controlar la aberración esférica. Debe tenerse en cuenta que al emplear un objetivo de inmersión en aceite, sin el aceite de aplicación entre el cubreobjetos y el primer elemento de lente, resultarán imágenes defectuosas. Esto se debe a la refracción que se produce en la superficie de la lente frontal, la cual introduce aberración esférica imposible de corregir por los componentes de lente posteriores dentro del objetivo.

Las ventajas de los objetivos de inmersión en aceite merman si se utiliza un líquido de inmersión incorrecto. Los fabricantes de microscopios producen objetivos con tolerancias limitadas al índice de refracción y dispersión, que precisan valores correspondientes con el líquido que se sitúa entre el cubreobjetos y la lente frontal del objetivo. Es recomendable emplear solo el aceite previsto por el fabricante del objetivo y no mezclar aceites de inmersión de diferentes fabricantes para evitar artefactos no deseados como la cristalización o la separación de fase.

Los objetivos que utilizan agua o glicerina como medio de inmersión para la digitalización de imágenes también están disponibles para aplicaciones de cultivo de células vivas o secciones tisulares sumergidos en una solución salina fisiológica. Las lentes de inmersión en agua planapocromáticas vienen equipadas con collares de corrección y aperturas numéricas de hasta 1,2, ligeramente inferiores a sus equivalentes de inmersión en aceite. Estos objetivos hacen posible que los microscopistas apliquen un enfoque de hasta 200 micras a través de un medio acuoso y sigan manteniendo una excelente corrección óptica. La desventaja es que las lentes de inmersión en agua con una apertura numérica elevada suelen costar varios miles de dólares y aun así la imagen puede sufrir degradación cuando el objetivo se centra profundamente a través de tejido o partes de la célula refractarios. Para obtener más información sobre los objetivos de inmersión en agua, glicerina y aceite, visite nuestra sección acerca de medios de inmersión en el manual básico de microscopía.

Hay una gran cantidad de información inscrita en el cilindro del objetivo, tal como se cubre en nuestra sección sobre especificaciones e identificación de los objetivos. En pocas palabras, en cada objetivo está inscrito su magnificación [o aumento] (p. ej. 10x, 20x o 40x, etc.); la longitud del tubo para el cual está diseñado el objetivo a fin de obtener las mejores imágenes (habitualmente 160 milímetros o el símbolo griego de infinito); y el espesor del cubreobjetos que protege la muestra, asumido por el diseñador como el que lleva un valor constante para la corrección de la aberración esférica (habitualmente 0,17 milímetros). Si el objetivo ha sido diseñado para funcionar con una gota de aceite entre el objetivo y la muestra, este tendrá un grabado con las siglas OIL, OEL o HI (inmersión homogénea). En casos en los que estas designaciones no estén grabadas en el objetivo, se prevé que el objetivo será utilizado en seco, con aire entre la parte más inferior del objetivo y la muestra. En los objetivos siempre aparece grabado el valor de la apertura numérica A. N. o NA (por sus siglas en inglés). Este puede variar desde 0,04 para objetivos con potencia baja hasta 1,3 o 1,4 para objetivos apocromáticos de inmersión en aceite de alta potencia. Si el objetivo no tiene ninguna designación relativa a una corrección más elevada, puede asumirse que es un objetivo acromático. Los objetivos con una corrección más elevada presentan el grabado apocromático o apo, plan, FL, flúor, etc. Los objetivos más antiguos suelen tener grabado en el cilindro la longitud focal (distancia longitud a imagen), que es una medida de la magnificación (aumento). En los microscopios modernos, el objetivo ha sido diseñado para una longitud del tubo óptico específica, de modo que incluir la longitud focal y la magnificación en el cilindro se convierte en algo redundante.

En la Tabla 2 se incluye la distancia de trabajo y la apertura numérica como función de la magnificación de las cuatro clases de objetivos más comunes: acromáticos, planacromáticos, planfuoritas y planacromáticos. Tenga en cuenta que los objetivos secos tienen un valor de apertura numérica inferior a 1,0 y solo los objetivos diseñados para medios de inmersión líquidos tienen una apertura numérica superior a este valor.

Especificaciones del objetivo por magnificación (aumento)

Tabla 2

Cuando se monta un conjunto de objetivos combinados de un fabricante (p. ej., todos los objetivos acromáticos de varias magnificaciones [un subconjunto individual de los objetivos indicados en la Tabla 2]) en el portaobjetivos, estos suelen estar diseñados para proyectar una imagen de casi el mismo plano que el tubo del cuerpo. De esta manera, cambiar los objetivos al girar el portaobjetivos suele requerir un uso mínimo de la rueda o tornillo micrométrico para restablecer el enfoque nítido. Dicho conjunto de objetivos se describe como parfocal: una útil función de comodidad y seguridad. Los conjuntos de objetivos combinados también han sido diseñados para que sean parcéntricos; por tanto, una muestra centrada en el campo visual de un objetivo seguirá estando centrada cuando se gira el portaobjetivos para usar otro objetivo.

Durante muchos años, las lentes de objetivos diseñadas para aplicaciones biológicas, provenientes de la mayoría de los fabricantes, cumplían con una norma internacional de distancia parfocal. De esta manera, la mayoría de los objetivos presentaba una distancia parfocal de 45,0 milímetros y se consideraba que eran intercambiables. Tras la migración a longitudes de tubos corregidos al infinito, apareció un nuevo grupo de criterios en términos de diseño para corregir las aberraciones en el objetivo y las lentes del tubo. Junto con el aumento de la demanda por una mayor flexibilidad para cubrir la necesidad de distancias de trabajo mucho más extensas con aperturas numéricas y tamaños de campo superiores, la intercambiabilidad entre las lentes del objetivo de diferentes fabricantes desapareció. Esta transición se ejemplifica por el moderno sistema óptico Nikon CFI-60 que incorpora objetivos «sin cromo», lentes del tubo y oculares. Todos los componentes del sistema CFI-60 se corrigen por separado sin utilizar uno para corregir el otro. La longitud del tubo se ajusta al infinito (trayectoria de luz paralela) utilizando una lente de tubo, y la distancia parfocal ha aumentado hasta 60 milímetros. También se ha alterado el tamaño de la rosca de montaje del objetivo de 20,32 a 25 milímetros para satisfacer los nuevos requisitos del sistema óptico.

El diámetro del campo en un microscopio óptico se expresa por el número del campo visual o simplemente el número de campo, que es el diámetro del campo visual expresado en milímetros y medido en el plano de la imagen intermedio. El diámetro del campo en el plano del objeto (muestra) se convierte en el número de campo dividido por la magnificación del objetivo. Aunque el número de campo se encuentra con frecuencia limitado por la magnificación y el diámetro del diafragma de campo del ocular, claramente hay un límite que viene impuesto también por el diseño del objetivo. En los primeros objetivos microscópicos, el diámetro de campo máximo aplicable se encontraba limitado a unos 18 milímetros (o muchos menos para oculares con magnificación elevada); pero, los objetivos planapocromáticos modernos y otros objetivos de campo plano especializados presentan frecuentemente un campo útil que puede abarcar de 22 a 28 milímetros o más si se combina con oculares de campo amplio. Desafortunadamente, el número máximo de campo útil no suele estar grabado en el cilindro del objetivo ni tampoco suele estar indicado en los catálogos de microscopios.

El rango axial, a través del cual un objetivo puede enfocarse sin ningún cambio apreciable en la nitidez de la imagen, se denomina profundidad de campo del objetivo. Este valor varía considerablemente entre los objetivos con una apertura numérica de baja a alta, y habitualmente disminuye al aumentar la apertura numérica (ver Tabla 3 y Figura 7). Mediante altas aperturas numéricas, la profundidad de campo se determina principalmente por la óptica ondulatoria, mientras que, con aperturas numéricas bajas, domina el «círculo de confusión» de la óptica geométrica. La profundidad de campo total se indica mediante la suma de las profundidades de campo de la onda y óptica geométrica:

dtot = λn/NA2 + (n/M•NA)e

donde λ es la longitud de onda de la iluminación; n es el índice de refracción del medio de adquisición de imágenes, NA es la apertura numérica (A. N.) del objetivo, M es la magnificación lateral del objetivo y e es la distancia menor que puede resolverse mediante un detector colocado en el plano de la imagen del objetivo. Note que la profundidad de campo limitada por la difracción (el primer término a la derecha de la ecuación) disminuye de forma inversa con el cuadrado de la apertura numérica, mientras que el límite lateral de la resolución se reduce con la primera potencia de la apertura numérica. El resultado es que la resolución axial y el espesor de las secciones ópticas se ven afectados por la apertura numérica del sistema mucho más que la resolución lateral del microscopio (ver Tabla 3).

Profundidad de campo y profundidad de la imagen

Tabla 3

La distancia requerida entre la superficie más cercana del cubreobjetos y la lente frontal del objetivo se denomina distancia de trabajo. En aquellas situaciones en las que la muestra se ha diseñado para obtener la imagen sin cubreobjetos, la distancia de trabajo se mide a partir de la superficie real de la muestra. Generalmente, la distancia de trabajo disminuye entre una serie de objetivos combinados a medida que la magnificación (aumento) y la apertura numérica se acrecientan (ver Tabla 2). Los objetivos previstos para ver muestras mediante aire, como medio de digitalización de imágenes, deben tener distancias de trabajo lo más largas posible, siempre que los requisitos de apertura numérica se satisfagan. Por otro lado, los objetivos de inmersión deben presentar distancias de trabajo menos profundas con el fin de contener el líquido de inmersión entre la lente frontal y la muestra. Muchos objetivos diseñados con distancias de trabajo estrechas cuentan con un tope de retracción retráctil que permite al ensamble de la lente frontal retraerse al presionar el cuerpo del objetivo y girarlo para bloquearlo en su posición. Este accesorio es conveniente cuando el objetivo es girado en el portaobjetivos, de modo a no arrastrar el aceite de inmersión por la superficie de un portaobjetos limpio. Si se gira el tope de retracción en la dirección opuesta, se libera el ensamble de la lente para su uso. En algunas aplicaciones (ver a continuación), es indispensable tener habilitada una distancia de trabajo larga, y objetivos especiales han sido diseñados para dicho uso a pesar de la dificultad implicada en lograr aperturas numéricas grandes y el nivel necesario de corrección óptica.

Uno de los avances más relevantes de los últimos años en el diseño de objetivos es la mejora de la tecnología de revestimiento antirreflexión, que ayuda a reducir las reflexiones indeseadas producidas cuando la luz atraviesa un sistema de lente. Cada interfaz aire-vidrio sin revestimiento puede reflejar entre el 4 y el 5 % de un haz luminoso de incidencia normal en la superficie, lo que causa un valor de transmisión del 95 al 96 % bajo una incidencia normal. La aplicación de un revestimiento antirreflexión con un espesor de cuarto de longitud de onda con el índice de refracción apropiado puede disminuir este valor de 3 al 4 %. A medida que los objetivos se hacen más sofisticados con un número creciente de elementos de lente, la necesidad de eliminar reflexiones internas crece de forma correspondiente. Algunas lentes de objetivo modernas con un nivel elevado de corrección pueden contener hasta 15 elementos de lente con muchas interfaces aire-vidrio. Si las lentes presentan revestimiento, las pérdidas de reflexión de los rayos axiales podrían disminuir los valores de transmitancia de aprox. 50 %. Estos revestimientos de lente de capa individual que se utilizaban para reducir la luz deslumbradora y mejorar la transmisión han sido sustituidos por revestimientos multicapa que producen valores de transmisión superiores al 99,9 % en el rango espectral visible.

En la Figura 8 podemos ver un esquema de ondas de luz que se reflejan desde un elemento de lente revestido con dos capas antirreflectantes o que pasan por él. La onda incidente entra en contacto con la primera capa (capa A en la Figura 3) en ángulo, lo que causa que parte de la luz se refleje (Ro) y parte de la luz se transmita a través de la primera capa. Tras llegar a la segunda capa antirreflectante (capa B), otra porción de la luz se refleja en el mismo ángulo e interfiere con la luz reflejada de la primera capa. Parte de las ondas de luz restantes permanecen en la superficie de vidrio donde nuevamente se reflejan y se transmiten. La luz reflejada desde la superficie de vidrio interfiere (a nivel constructivo y destructivo) con la luz reflejada desde las capas antirreflectantes. Los índices de refracción de las capas antirreflectantes se diferencian de aquellos del vidrio y el medio circundante (aire). A medida que las ondas de luz atraviesan las capas antirreflectantes y la superficie del vidrio, la mayor parte de la luz (en función del ángulo de incidencia, que suele ser perpendicular a la lente de la microscopía óptica) se transmite a través del vidrio y se enfoca en forma de imagen.

El fluoruro de magnesio es uno de los muchos materiales que se utilizan para los revestimientos antirreflectantes ópticos de capa fina, pero la mayoría de los fabricantes de microscopios ahora producen sus propias fórmulas patentadas. El resultado general es una mejora radical en el contraste y la transmisión de las longitudes de onda visibles con una interferencia destructiva simultánea en frecuencias relacionadas armónicamente, las cuales se hallan fuera de la banda de transmisión. Estos revestimientos especializados pueden dañarse fácilmente si se exponen a una inadecuada manipulación; por tanto, el microscopista debe ser consciente de dicha vulnerabilidad. Los revestimientos antirreflectantes multicapas tienen un tinción ligeramente verde, a diferencia de la tinción morada de los revestimientos de una capa, algo que puede usarse para distinguir los revestimientos. La capa superficial de los revestimientos antirreflectantes, que se usan en lentes internas, es mucho más suave que los revestimientos correspondientes diseñados para proteger las superficies de las lentes externas. Se debe proceder con especial cuidado al limpiar superficies ópticas revestidas con películas finas, especialmente si el microscopio ha sido desensamblado y los elementos de las lentes internas están siendo examinados.

La longitud focal de un sistema de lentes se define como la distancia desde el centro de una lente hasta un punto en el que los rayos paralelos se enfocan en el eje óptico (con frecuencia denominado punto focal principal). Un plano imaginario perpendicular al punto focal principal recibe el nombre de plano focal del sistema de lentes. Cada lente tiene dos puntos focales principales para que la luz entre a partir de cada lado, uno por la parte frontal y otro por la trasera. Por convención, el plano focal del objetivo que está más cerca al elemento de la lente frontal se conoce como plano focal frontal y el plano focal ubicado detrás del objetivo se denomina plano focal trasero. La posición real del plano focal trasero varía en función de la construcción del objetivo, pero se sitúa generalmente en algún lugar dentro del cilindro del objetivo para objetivos con alta magnificación. Los objetivos con una magnificación inferior suelen tener un plano focal trasero que es exterior en el cilindro, situado en el área roscada o dentro del portaobjetivos del microscopio.

A medida que los rayos de luz atraviesan un objetivo, estos se ven limitados por la apertura trasera o la pupila de salida del objetivo. El diámetro de esta apertura varía entre 12 milímetros para objetivos con una magnificación baja y hasta unos 5 milímetros para los objetivos apocromáticos con la mayor potencia. El tamaño de la apertura es extremadamente crítico para las aplicaciones de iluminación episcópica que emplean el objetivo como sistema de procesamiento de imágenes y condensador, donde la pupila de salida se convierte también en pupila de entrada. La imagen de la fuente de luz debe llenar por completo la apertura trasera del objetivo para producir iluminación incluso en el campo visual. Si la imagen de la fuente de luz es más pequeña que la apertura, se produce una degradación de los bordes en el campo visual de la iluminación irregular. Por otro lado, si la imagen de la fuente de luz es más grande que la apertura trasera, parte de la luz no entra en el objetivo y se reduce la intensidad de la iluminación.

En conclusión, el desarrollo de los objetivos microscópicos de alta calidad comenzó con Ernst Abbe, que desarrolló por primera vez los objetivos apocromáticos y los oculares de compensación durante el final de la década de 1880 en colaboración Carl Zeiss y Otto Schott. El siguiente avance clave en el diseño de objetivos se produjo cuando Hans Boegehold (Zeiss) fabricó los primeros objetivos planacromáticos y planapocromáticos a finales de la década de 1930. Más recientemente, el desarrollo de la óptica «Chrome Free» (CF, sin cromo) por Zenji Wahimoto (Nikon) y Horst Riesenberg (Zeiss) ha iniciado una nueva revolución en el diseño de objetivos microscópicos.

Muchos de los objetivos microscópicos que se producen en la actualidad ofrecen grados de aberración sorprendentemente bajos y otras imperfecciones, siempre que se seleccione el objetivo adecuado y se utilice debidamente. No obstante, el microscopista tiene que ser consciente de que los objetivos no se han diseñado para ser perfectos desde cualquier punto de vista, sino que buscan satisfacer un cierto conjunto de especificaciones en función del uso previsto, las restricciones de las dimensiones físicas y los rangos de precios. Por lo tanto, los objetivos se fabrican con diferentes grados de corrección para la aberración cromática y esférica, el tamaño de campo y planitud, las longitudes de onda de transmisión, la ausencia de fluorescencia, birrefringencia y otros factores que contribuyen al ruido de fondo. Además, han sido diseñados para usarlos en ciertas condiciones limitadas, como con longitudes de tubo específicas y lentes de tubos, tipo y espesor de los medios de inmersión y cubreobjetos, rangos de longitud de onda, tamaños de campos, tipos de oculares y condensadores especiales. El objetivo final del microscopio óptico es ofrecer una magnificación útil que permita que diminutas muestras se observen con gran detalle, y exponer así un mundo escondido de objetos invisibles que, de lo contrario, permanecerían ocultos.