La microscopía de campo oscuro es una técnica que se beneficia de la iluminación oblicua para mejorar el contraste en especímenes cuya visualización es difícil bajo condiciones de iluminación normal.

Después de que se bloquea la luz directa mediante un tope opaco en el condensador, la luz que atraviesa la muestra desde ángulos oblicuos se difracta, se refracta y se refleja en el objetivo del microscopio para formar una imagen brillante de la muestra superpuesta sobre un fondo oscuro.

Este fondo oscuro proporciona un elevado nivel de contraste y permite que las muestras con fondos complejos destaquen mediante un esfuerzo relativamente bajo. A continuación, visualice algunos ejemplos.

Derecha: Espiráculo y tráquea de la larva de un gusano de seda. Las diminutas piezas de madera fragmentada adquieren un aspecto de belleza inusual al ser iluminadas bajo condiciones de campo oscuro con un microscopio de luz transmitida.

Izquierda: Mariposa. Las mariposas, debido al amplio espectro de patrones de escamas que llevan en sus alas —propios de los miembros de este orden—, son uno de los miembros más coloridos del mundo de los insectos. La imagen digital muestra las numerosas escamas diminutas que adornan casi toda la superficie del ala de una mariposa. Las escamas de las alas fueron iluminadas con un condensador de campo oscuro y se capturaron en baja magnificación (50x).

¿Cómo funciona la microscopía de campo oscuro?

La iluminación de campo oscuro precisa el bloqueo de la mayor parte de la luz que normalmente viaja a través y alrededor del espécimen; esto posibilita la interacción exclusiva de los rayos oblicuos con el espécimen.

La lente superior de un simple condensador de campo oscuro Abbe es esférica cóncava, lo que permite que los rayos de luz emitidos por la superficie de la lente superior formen un cono de luz hueco invertido con el enfoque centrado en el plano del espécimen. En la áreas donde hay ausencia de muestra y la apertura numérica del condensador es superior a la del objetivo, los rayos oblicuos se cruzan entre sí obviando el objetivo y dejan dichas áreas oscuras.

Cuando un espécimen (especialmente uno sin tinción ni capacidad de absorción de luz) es colocado en un portaobjetos, los rayos oblicuos interactúan con el espécimen y son difractados, reflejados o refractados por elementos pertenecientes a la propia muestra, como la membrana celular, el núcleo y los orgánulos internos. Esto permite que los rayos débiles entren en contacto con el objetivo. El resultado es una muestra clara sobre un fondo negro.

¿Qué componentes son necesarios para la microscopía de campo oscuro?

La mayoría de los microscopios de laboratorio de campo claro pueden ser modificados con facilidad para llevar a cabo la iluminación de campo oscuro. La forma más simple de hacerlo es cambiando el condensador en curso por uno configurado para la iluminación de campo oscuro (Figura 1).

Estos condensadores son relativamente sencillos y ofrecen la alta apertura numérica (NA) que se requiere para crear el cono de iluminación dedicado a la observación de campo oscuro. Sin embargo, el cambio de condensadores en función del tipo de iluminación es poco práctico si se usa a diario un microscopio. Por suerte, existe una solución.

Varios condensadores pueden albergar inserciones que permiten crear un cono de iluminación. Estas inserciones no ofrecen una apertura numérica tan alta como la de un condensador específico de campo oscuro; por lo tanto, no todos los objetivos pueden ser usados con ellas. Pero, las inserciones ofrecen la flexibilidad para adaptar múltiples métodos de observación en un mismo condensador.

Figure 1. Condensador configurado para la iluminación de campo oscuro

¿Por qué la microscopía de campo oscuro es una buena técnica para el procesamiento de imágenes?

Por lo general, los objetos analizados bajo las condiciones adecuadas de iluminación de campo oscuro son un deleite para la vista. A menudo, los especímenes que presentan un contraste inherente muy bajo en la microscopía de campo claro brillarán mucho bajo la observación de campo oscuro.

La iluminación de campo oscuro es idónea para revelar contornos, bordes, límites y gradientes de índice de refracción. Y, los candidatos ideales para la iluminación de campo oscuro son los diminutos organismos acuáticos vivos, las diatomeas, los insectos pequeños, los huesos, las fibras, el pelo, las bacterias sin tinción, las levaduras, las células en cultivo de tejidos y los protozoarios (o protozoos).

Entre las muestras no biológicas se encuentran los cristales de propiedades minerales y químicas, las partículas coloidales, las muestras de recuento de polvo y las secciones finas de polímeros y cerámicas que contienen pequeñas inclusiones, diferencias de porosidad o gradientes de índice de refracción.

A continuación, se proporcionan algunos ejemplos de especímenes capturados con el procesamiento de imágenes de campo oscuro:

Izquierda: Esta espectacular fotomicrografía de campo oscuro de la diatomea Arachnoidiscus ehrenbergi fue capturada con un microscopio Olympus por Mortimer Abramowitz. La muestra fue iluminada con un condensador de campo oscuro de alta apertura numérica con aceite de inmersión colocado entre la platina del microscopio y las lentes frontales del objetivo y del condensador. Centro: Tilo. Las muestras teñidas son a menudo excelentes candidatas para la microscopía de campo oscuro, ya que producen imágenes sublimes, representadas en color sobre un fondo oscuro. Esta fotomicrografía ilustra una sección fina de un tilo con tinción bajo la iluminación de campo oscuro. Derecha: ADN de cristal líquido. Esta solución de ADN altamente concentrada ha experimentado una serie de transiciones en la fase líquido-cristalino hasta formar una fase hexagonal densamente empaquetada. Esta fotomicrografía fue capturada con un microscopio óptico compuesto dotado de un objetivo de 10x bajo la iluminación de campo oscuro.

Por desgracia, la iluminación de campo oscuro es menos útil para revelar detalles internos. Asimismo, existen otras condiciones que deben ser consideradas si se desea sacar el máximo provecho de la iluminación de campo oscuro.

¿Cuáles son los desafíos que se plantean al usar la microscopía de campo oscuro?

Cuando se usa la microscopía de campo oscuro, es necesario tener sumo cuidado al preparar las muestras, ya que las características que se encuentran por encima y por debajo del plano de enfoque pueden dispersar la luz y contribuir a la degradación de la imagen. La limpieza del portaobjetos es un factor importante a la hora del procesamiento de imágenes, pero es aún más importante cuando se aplica la técnica de campo oscuro, ya que cada trozo de residuo se iluminará y puede restar importancia a lo que intenta observar.

Los otros desafíos que pueden plantearse al configurar un microscopio para una observación en campo oscuro son:

• Iluminación insuficiente para hacer visible el espécimen, o el espécimen es visible a un nivel muy débil.

  La microscopía de campo oscuro requiere una gran cantidad de luz para obtener una imagen adecuada, debido a que gran parte de ella es bloqueada para formar el cono. Por lo tanto, no dude en incrementar la potencia; pero, considere que algunas muestras puedan ser incompatibles a tal cantidad de luz durante períodos prolongados.

• Platina que presenta una mancha oscura en el centro del campo de visión; sin embargo, los objetos de la periferia están bien iluminados y parecen estar en buenas condiciones.

  Normalmente, esto se produce cuando el condensador está mal alineado o enfocado. Debe corregirse el centrado y enfoque en el condensador para solucionar este problema. Esta solución es prescrita para la mayoría de los problemas en los que la iluminación parece irregular pero la muestra está enfocada.

• Colores que aparecen en el área de fondo; o, el área de fondo está iluminada de forma irregular mediante una tinción grisácea.

  Esto suele ser el resultado de una muestra demasiado gruesa que está montada en un medio contaminado. Volver a ubicar la muestra debería corregir la situación.

¿Cuáles son las ventajas obtenidas al usar la microscopía de campo oscuro?

La microscopía de campo oscuro proporciona muchas ventajas. El fondo oscuro ofrece un alto nivel de contraste, lo que favorece la visualización de las muestras sobre áreas de fondo complejo. Esta técnica es fácilmente accesible ya que muchos microscopios de laboratorio de campo claro pueden ser configurados para integrar la iluminación de campo oscuro. Además de las ventajas que aporta en el campo de la microscopía, las imágenes obtenidas con la técnica de campo oscuro pueden incluso parecer obras de arte debido a la exquisita iluminación que produce en las muestras.

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