En la investigación avanzada de las ciencias de la vida, la microscopía de fluorescencia es una técnica de procesamiento de imágenes muy reconocida y poderosa. Mediante un marcado específico de los fluorocromos en un objetivo, la señal de fluorescencia emitida puede ofrecer un excelente contraste de procesamiento de imágenes con un fondo mínimo hasta el nivel molecular.

Tanto las innovadoras tecnologías ópticas como los enfoques de marcado extenso de la ingeniería genética de vanguardia son los factores de éxito de la microscopía de fluorescencia en la investigación biológica.

No obstante, a pesar de su éxito general, la necesidad de moléculas o marcados fluorescentes sigue limitando las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia:

• Muchas biomoléculas no son fluorescentes, son pequeñas y se ven alteradas fácilmente por los marcados fluorescentes.
• El nivel de expresión y la especificidad de los fluorocromos que viven en los organismos vivos, a veces, complican los resultados experimentales.
• El uso de marcados fluorescentes exógenos suscita preocupación en la investigación biomédica en humanos.

Debido a estas limitaciones, se prefieren los métodos de procesamiento de imágenes ópticas aplicando contraste en lugar de la fluorescencia. A través de esta publicación, se compartirán métodos alternativos con respecto al procesamiento de imágenes biológicas para ayudarle a evaluar más allá de la microscopía de fluorescencia y ampliar sus capacidades de investigación.

Evaluación más allá de la microscopía de fluorescencia

Los elementos ópticos no lineales pueden generar señales a partir de las propiedades intrínsecas de moléculas específicas y forman un contraste de procesamiento de imagen sin necesidad de usar la fluorescencia.

Gracias a la disponibilidad de técnicas microscópicas y fuentes láser avanzadas, los elementos ópticos no lineales no se encuentran limitados a los experimentos de laboratorio. Esto se ha convertido en una solución factible para la obtención de imágenes biológicas, lo que inspira a los investigadores a evaluar más allá de la microscopía de fluorescencia. Un buen ejemplo de ello es la microscopía de generación armónica óptica (HG).

Comprender la microscopía SHG y THG

En términos simples, HG es un proceso óptico no lineal en el que n fotones interactúan simultáneamente con el material y lo convierten en un fotón. La segunda generación armónica (SHG, dos fotones en un fotón) y la tercera generación armónica (THG, tres fotones en un fotón) son las técnicas de microscopía HG más usadas en el procesamiento de imágenes biológicas.

El proceso de conversión de fotones en SHG y THG se ilustra en el diagrama de Jablonski (Figura 1) a continuación: la SHG proporciona fotones con el doble de energía del fotón (media longitud de onda) y la THG proporciona fotones con el triple de energía del fotón (un tercio de longitud de onda) de fotones de excitación.

Figura 1: Diagrama de Jablonski de los procesos ópticos SHG y THG. Las líneas de puntos representan estados virtuales.

Al igual que la microscopía, la SHG y la THG necesitan una fuente de láser de impulso ultra rápido, normalmente en el rango de longitud de onda del infrarrojo cercano, a fin de completar el proceso óptico no lineal en un volumen focal de excitación pequeño. Como resultado, la microscopía SHG y THG tienen las siguientes características:

• Función de seccionamiento óptico intrínseco
• Procesamiento de imágenes profundas en tejidos muy diseminados
• Niveles bajos de fototoxicidad y fotoblanqueo
• Las intensidades de la señal SHG y THG son proporcionales al cuadrado y al cubo de la potencia de excitación láser, respectivamente.

Con todo, a diferencia de la microscopía multifotón, las señales de SHG y THG se generan a partir de la propiedad óptica y la estructura del material:

• La microscopía SHG suele aplicarse al procesamiento de imágenes de moléculas no centrosimétricas y estructuras ordenadas, como las fibras de colágeno, los microtúbulos, la miosina muscular, el almidón, los tejidos dérmicos y la estroma de la córnea.
• La microscopía THG suele aplicarse al procesamiento de imágenes de sustancias con un índice de refracción alto o interfaces (comparados con el agua circundante), tales como organelas celulares, glóbulos rojos o blancos, gotas lipídicas, tejido adiposo, vaina de mielina de axones y huesos.

Sin tener que usar los fluorocromos, tanto la microscopía SHG como la THG pueden lograr un procesamiento de imágenes sin marcado y proporcionar información estructural y molecular en tejidos biológicos, organismos vivos e incluso en el procesamiento de imágenes médicas para diagnósticos.

Figura 2: Imagen SHG/THG de un tejido adiposo porcino sin marcar, capturada con el microscopio multifotón FVMPE-RS de Olympus. La señal SHG (cián) muestra fibras de colágeno y la señal THG (magenta) muestra la grasa en el tejido adiposo.

Después de explicar los principios esenciales de la microscopía SHG y THG, la siguiente sección cubre los consejos que le permitirán poner en práctica estas técnicas.

Consideraciones prácticas para configurar la microscopía SHG y THG

Ya que la microscopía SHG y la THG pueden compartir la misma unidad de escaneo láser y la misma fuente láser de impulso NIR sin la microscopía multifotón, nuestro microscopio multifotón FVMPE-RS se combina con la microscopía SHG y THG para crear un sistema de procesamiento de imágenes multimodal.

A continuación se explican dos aspectos prácticos a considerar al configurar la microscopía SHG y la THG:

1. Detectores de alta sensibilidad y detección de avance:

   Aunque la emisión de fluorescencia suele ser isotrópica, las señales SHG y THG poseen un cierto grado de direccionalidad que se origina en el proceso de combinación de onda. En la mayoría de las muestras, la señal de avance (lejos del objetivo) es mucho más fuerte que la señal de retroceso (hacia el objetivo). En este caso, los detectores no descaneados transmitidos (NDD) y un condensador con una alta apertura numérica son la mejor combinación para detectar la señal de avance. En tejidos muy diseminados, una parte de la señal de avance puede retrodispersarse y ser detectada mediante la función de detección de señal de retroceso. En este caso, pueden usarse NDD de alta sensibilidad como el tubo fotomultiplicador de fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP) para optimizar la eficacia de detección de retroceso, especialmente cuando la detección de la señal de avance no puede aplicarse a animales vivos o muestras en masa.

2. Buena potencia de láser con una longitud de onda más larga:

   La señal THG requiere una buena potencia de excitación láser para completar el proceso óptico no lineal y se genera a un tercio de la longitud de onda de excitación. Para una mejor detección y transmisión de señales en la microscopía THG, utilice una fuente láser con una buena potencia dotada de una longitud de onda más larga que 1200 nm, de forma que la señal THG pueda estar situada dentro del rango de luz visible. En el pasado, se requería un láser de impulso NIR, un oscilador paramétrico óptico (OPO) y un operador especializado para generar una fuente láser superior a 1200 nm. En la actualidad, los avances tecnológicos láser nos permiten generar una imponente potencia láser dotada de una longitud de onda larga y proporcionada sólo a partir de un láser de impulso ultrarrápido, como el Spectra-Physics InSight^® X3.

Amplíe sus capacidades de investigación más allá de la microscopía de fluorescencia

Equipado con tecnologías láser y microscópicas innovadoras, nuestro sistema de procesamiento de imágenes multifotón FVMPE-RS le brinda la oportunidad de tener tanto la microscopía multifotón como la SHG y THG en una misma plataforma multimodal de procesamiento de imágenes. Gracias a estas funciones sumamente potentes, podrá ampliar sus capacidades de investigación más allá de la microscopía de fluorescencia.

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