En el año 2014, el Premio Nobel de Química fue concedido a tres científicos «por desarrollar un microscopio de fluorescencia con superresolución». A partir de ese momento, es decir durante los últimos cinco años, la industria de la microscopía ha vivido un aumento drástico de interés por las técnicas microscópicas de superresolución
Para aquellas personas que no están familiarizadas con este término, la microscopía de superresolución hace referencia a cualquier técnica óptica usada para visualizar muestras a una resolución más alta que el límite de difracción de los microscopios ligeros convencionales.
En esta publicación del blog analizaremos la microscopía de superresolución. Descubra los límites de los microscopios de superresolución y nuevas formas de habilitar la superresolución en sus sistemas microscópicos existentes.
Límites de los microscopios de superresolución
Hoy en día, casi todos los fabricantes de microscopios comerciales ofrecen microscopios de superresolución. Estos microscopios son casi igual de fáciles de usar que un microscopio confocal ordinario, pero no siempre ha sido así. Varios años han sido necesarios para crear un microscopio de superresolución intuitivo que no requiera el uso de expertos para su utilización y alineación.
Inicialmente, la comunidad de investigación mostró mucho interés en la superresolución. Pero este interés te desvaneció cuando los investigadores se dieron cuenta del nivel de esfuerzo necesario para realizar los experimentos. Los beneficios no compensaban los esfuerzos necesarios para modificar la preparación de las muestras, modificar los medios de procesamiento de imágenes o realizar tareas muy tediosas como la correspondencia del índice de refracción.
¿Los microscopios confocales pueden procesar imágenes de superresolución?
Se ha demostrado que reducir el tamaño del estenopo por debajo de 1 AU en los microscopios confocales ayuda a aumentar la resolución.
Teóricamente, al hacer esto se podría duplicar la resolución y obtener lo que suele conocerse como superresolución. Pero, en la práctica, se demostró que la resolución solo podía mejorarse 1,4 veces aproximadamente porque las señales de alta frecuencia son débiles si se comparan con las señales de baja frecuencia abundantes.
Como resultado, los esfuerzos se centraron en averiguar de qué forma las tecnologías existentes, como la microscopía confocal, podían mejorarse para usar la información especial de alta frecuencia que ya existía en dichas imágenes. Como era de esperar, la deconvolución fue una de las sugerencias.
¿Cómo funciona la deconvolución?
Los algoritmos de deconvolución trabajan reasignando los fotones desenfocados a sus posiciones originales, partiendo de una función de extensión de punto adquirido o teórico (PSF) para aumentar la nitidez y la claridad de las imágenes adquiridas.
De hecho, los algoritmos de deconvolución pueden reducir por ellos mismos el tamaño de ancho completo de una perla fluorescente, a la mitad como máximo (FWHM), para poder duplicar la resolución sobre el amplio campo.
Volvamos un momento hacia atrás para definir la resolución en el contexto de la microscopía. Tradicionalmente, esta se define usando el Criterio de Rayleigh, en donde debe haber al menos una reducción del 26 % en la intensidad entre dos objetos para poder definirlos correctamente como dos objetos separados.
De forma más común, se le conoce como resolución de dos puntos. Si reducimos el FWHM de un objeto de infra resolución a través de la deconvolución obtendremos imágenes más nítidas, pero esto podría no ser suficiente para conseguir una superresolución.
Esto plantea la siguiente pregunta: ¿la deconvolución es suficiente para proporcionar datos reales de superresolución en muestras reales?
La respuesta es no.
Uno de los métodos de deconvolución lineal más populares es el filtro Wiener. El filtro Wiener gestiona datos de alta frecuencia de la misma forma, lo que provoca la formación de artefactos de anillos, como puede verse en la siguiente imagen:
Algunas personas afirman que estos artefactos pueden minimizarse modificando la resistencia del filtro o bloqueando a los investigadores fuera de ellos completamente. Pero la realidad es que los artefactos grandes no son aceptables cuando se observan estructuras por debajo del límite de resolución.
Por todo ello, Olympus ha desarrollado la superresolución.
Adquiera imágenes (súper) claras con la superresolución de Olympus
¿Qué es exactamente la superresolución de Olympus? OSR es un proceso de filtrado que amplifica o atenúa la información espacial de alta frecuencia específica para ofrecer un resultado más fiable.
Este proceso puede combinarse con los algoritmos de deconvolución para crear imágenes de superresolución más nítidas y más claras.
Póngase en contacto con nosotros hoy mismo para saber de qué forma la superresolución de Olympus puede ayudarle a adquirir imágenes claras en su microscopio.
