Los microscopios de escaneo láser confocal son herramientas muy populares en la investigación biológica. Suelen ser usados para digitalizar varios fluorocromos a la vez a través de una discriminación cromática correcta, como también la profundidad de un imagen a partir del interior de una muestra biológica gracias a funciones mejoradas de seccionamiento óptico.
Las recientes innovaciones en tecnología láser favorecen este tipo de aplicaciones y permiten ejecutar experimentos más avanzados. A través de este blog, se explicará cómo los novedosos láseres de excitación del infrarrojo cercano (NIR), implementados en nuestros microscopios confocales FV4000, están mejorando muchas aplicaciones de multiplexación avanzada.*
Multiplexación de más de cinco canales en microscopía confocal: Superar los retos técnicos con el sistema FV4000
Primero, se proporcionará una breve reseña sobre los experimentos de multiplexación.
Durante años, los investigadores han empleado la inmunofluorescencia con el colorante DAPI y otros dos colores, normalmente a nivel del espectro del verde y el rojo.
No obstante, al mismo tiempo que los avances en anticuerpos y sistemas de procesamiento de imágenes progresaban en paralelo a más detectores y a un mejor filtrado de la longitud de la onda emisora, la inmunofluorescencia de cuatro colores también ganaba popularidad. La combinación más común de estos cuatro colores se definía por DAPI, verde, rojo y rojo lejano.
Sin embargo, había dos factores críticos que ponían trabas a la introducción de un quinto o sexto canal en la multiplexación:
1. Una falta de diodos láser NIR con buena calidad de haz
En un principio, no existían muchos diodos láser de infrarrojo cercano (NIR) con buena calidad de haz para los microscopios de escaneo láser confocal. Los diodos láser requieren una potencia adecuada (no tan elevada), fluctuaciones de potencia mínimas y perfiles de haz compatibles para aplicarlos en el procesamiento de imágenes confocal. Sin embargo, hasta hace poco sólo se disponía de pocas opciones de diodos láser de NIR en estos rangos de longitud de onda.
Pero todo ha cambiado gracias a la última tecnología de diodo láser. Nuestro microscopio confocal FV4000 ofrece ahora diodos láser de 685 nm, 730 nm y 785 nm para la excitación eficaz de colorantes secundarios, como los de la siguiente tabla.
| Láser | Colorante fluorescente | λ_Ex (nm) | λ_Em (nm) |
|---|---|---|---|
| LD685 | Alexa Fluor 680 | 679 | 702 |
| DyLight 680 | 692 | 712 | |
| Alexa Fluor 700 | 696 | 719 | |
| iRFP720 | 702 | 720 | |
| LD730 | ATTO 740 | 743 | 763 |
| DiR | 750 | 782 | |
| Alexa Fluor 750 | 752 | 779 | |
| Cy7 | 753 | 775 | |
| DyLight 755 | 754 | 776 | |
| LD785 | DyLight 800 | 777 | 794 |
| Colorante IR 800CW | 778 | 794 | |
| Alexa Fluor 790 | 782 | 805 | |
| Cy7.5 | 790 | 810 |
Estos colorantes, junto con un número creciente de nuevos fluorocromos, están favoreciendo la incorporación de un quinto y sexto canal simultáneo para que la multiplexación sea cada vez más impactante.
2. Tubos fotomultiplicadores con sensibilidad reducida en longitudes de onda de NIR
Otra complicación con respecto a lograr un procesamiento de imágenes NIR eficaz es que muchos tubos fotomultiplicadores (PMT), usados como detectores estándares para los microscopios confocales de barrido/escaneo láser, presentan una sensibilidad reducida en cuanto a la detección de longitudes de onda típicas provenientes de la región de las longitudes de onda del NIR (por encima de 750 nm).
Esta sensibilidad reducida en los rangos de detección del infrarrojo cercano es especialmente evidente con los populares PMT de GaAsP que ofrecen una mayor sensibilidad en la mitad del espectro visible. En el rango de 750+ nm, los detectores de GaAsP proporcionan muy poca sensibilidad.
Para superar este reto, hemos implementado la tecnología de detección SilVIR en nuestro microscopio confocal de escaneo láser FV4000. Nuestro detector SilVIR utiliza un fotomultiplicador de silicio (SiPM): un sensor semiconductor que permite la adquisición espectral de imágenes de fluorescencia con una óptima relación señal-ruido a través de una amplia escala de longitudes de onda, de 400 nm a 900 nm.
Gracias a esta tecnología, nuestro sistema FV4000 ofrece un detector SilVIR de hasta seis canales para aplicaciones de multiplexación. Combinado con nuestros objetivos de alto rendimiento X Line™, el sistema FLUOVEW™ FV4000 pueden ofrecer una corrección de aberración cromática amplia y de alta calidad que va de 400 a 1000 nm. La combinación entre detectores SilVIR y objetivos X-Line ™ da lugar a una mayor fiabilidad en el procesamiento de imágenes de fluorescencia con multiplexación y la imagen NIR en general.
*Este artículo ha sido actualizado a partir del contenido original publicado el 21 de enero de 2020.
