Los sistemas microscópicos de hoy capturan sistemas complejos con alta precisión; esto los hace vitales para los investigadores de ciencias de la vida que tratan de comprender los mecanismos biológicos. Sin embargo, al igual que ocurre con cualquier otro instrumento de laboratorio destinado a la investigación, su microscopio debe cumplir con un rendimiento constante para producir datos reproducibles.

Esto plantea un desafío, ya que los instrumentos de microscopía y los análisis de imágenes son cada vez más complejos.

A través de este artículo, se explica de forma más detenida la importancia de supervisar el rendimiento de los microscopios y cómo las herramientas analíticas pueden ayudarle a identificar factores que introducen sesgos en sus resultados.

¿Cómo se generan los sesgos en los datos experimentales?

Los sesgos puede introducirse fácilmente en su experimento a partir de múltiples fuentes. Tome en cuenta el siguiente ejemplo de un análisis morfológico. Cuando se busca medir los cambios en una estructura celular, es necesario tomar imágenes y medir las diferencias morfológicas. No obstante, pueden generarse sesgos en sus imágenes y en los resultados subsiguientes debido a la preparación de la muestra o las variaciones biológicas en el espécimen, incluso si el funcionamiento de su microscopio es adecuado. Esto plantea un desafío en la adquisición de datos precisos y reproducibles.

Ahora imagine que la tarea fue realizada usando un microscopio sin calibrar. Esto introduciría un sesgo adicional en la imagen generado por el propio microscopio, y las mediciones posteriores carecerían de exactitud y precisión. Por consiguiente, sería difícil reproducir el mismo conjunto de datos al ejecutar nuevamente el mismo experimento.

Esto supone un grave problema para aquellos investigadores que desean publicar sus datos experimentales. Por otra parte, piense en ese revisor que le solicita repetir un experimento. Sin una instrumentación calibrada, puede que se enfrente a enormes dificultades para lograr resultados comparables.

A pesar de que poco puede hacerse para reducir las variaciones biológicas de un espécimen, existen formas de supervisar el rendimiento de su microscopio y descubrir dónde se está generando el sesgo a la hora de llevar a cabo el procesamiento de imágenes y las mediciones. Estas opciones serán expuestas más adelante tras la revisión de los errores y los sesgos detectados en las mediciones cuantitativas.

Errores en las mediciones cuantitativas

Con un microscopio es posible ejecutar una gran variedad de análisis cuantitativos distintos. La mayoría de las aplicaciones cuantitativas comportan la medición y comparación de la intensidad de fluorescencia o de los cambios espaciales dentro de una imagen.

Todas las mediciones cuantitativas contienen cierto grado de error o sesgo. Este error puede ser introducido por la muestra o el microscopio, y puede manifestarse en forma de inexactitud o imprecisión en las mediciones. La inexactitud produce mediciones incorrectas consistentes, mientras que la imprecisión genera variación en las mediciones repetidas. Las dos son enemigas de los datos reproducibles.

Antes, muchos estudios analíticos de imágenes se basaban en mediciones manuales a la hora de llevar a cabo análisis cuantitativos. Durante las dos últimas décadas, se ha observado una tendencia hacia el análisis bioinformático de imágenes, como también hacia herramientas de software, como los programas de inteligencia artificial, que pueden automatizar las mediciones y aumentar enormemente la capacidad de producción. Por tal motivo, la cantidad de datos generados a partir de los experimentos de microscopía cuantitativa ha alcanzado nuevas cotas.

Dado que los investigadores producen cada vez más imágenes por experimento, y que esas imágenes se incorporan a modelos complejos para ser analizadas y extraer su información relevante, es imprescindible partir de un conjunto de imágenes con la mayor calidad y estabilidad posibles. Si el procesamiento de imágenes se ejecuta a lo largo de varios días, no cabe duda de que la utilización de un microscopio con un rendimiento inestable durante ese tiempo introducirá importantes irregularidades en sus datos. Más allá de la potencia de su software de análisis, las imágenes validadas en terreno son las que más influyen en la consistencia y fiabilidad de sus datos.

Las situaciones de error no se deben sólo a un software de mayor capacidad de producción y análisis. Los sistemas microscópicos de hoy en día son más complejos que nunca, ya que incorporan diversos componentes ópticos, mecánicos y eléctricos. Por consiguiente, a medida que aumenta el número de componentes complejos, también lo hacen las posibilidades de que se produzcan desajustes, disfunciones o averías en estos instrumentos.

Si la complejidad de los sistemas microscópicos puede adicionar un sesgo a sus datos, ¿qué puede hacerse para supervisar el rendimiento del microscopio y garantizar la consistencia de los resultados?

Herramientas y soporte para supervisar el rendimiento del microscopio

Cuando usted adquiere por vez primera un sistema microscópico, los principales fabricantes, como Evident, le entregan un microscopio con unos parámetros de rendimiento rigurosos y muy bien definidos. Durante la instalación, se sigue un protocolo preciso para garantizar que el microscopio cumpla con la normativa de fábrica.

Con el paso del tiempo, es posible que algunos parámetros de funcionamiento queden fuera de un rango aceptable; por eso, es sumamente importante llevar a cabo un análisis de rendimiento de su microscopio. Debe asegurarse de que el funcionamiento de su microscopio sea constante, independientemente de que haya transcurrido un día, un mes o un año desde su compra.

En el pasado, conocer el rendimiento de un microscopio era un proceso laborioso, que solía requerir el uso de herramientas de calibración para trazar una curva de calibración de la intensidad de salida en función del porcentaje de transmitancia. Los parámetros específicos para el diagnóstico y la solución de problemas (p. ej., la resolución o la homogeneidad) también ha supuesto un desafío, ya que se requerían otras herramientas de diagnóstico y solución de problemas para detectar fallos específicos de funcionamiento.

Herramientas integradas para supervisar el rendimiento del microscopio

Hoy en día, existen soluciones más rápidas y sencillas que no exigen ese arduo trabajo al supervisar el rendimiento de los microscopios. Considere el siguiente ejemplo: En la microscopía longitudinal por intervalos, algunos sistemas microscópicos son susceptibles a sufrir fluctuaciones en su rendimiento durante largos períodos. Esto produce imágenes por intervalos de calidad variable.

Una solución moderna es el microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW™ FV3000, que proporciona una potencia láser estable para estos experimentos. En esta unidad de escaneo, un sistema óptico de monitorización de la intensidad y control de la retroalimentación proporciona una intensidad de excitación estable durante los estudios por intervalos prolongados. Esta puede apreciarse en las imágenes por intervalos que se muestran a continuación (Figura 1).

Figura 1. Imágenes por intervalos tomadas con el microscopio confocal FV3000. Línea celular KHYG-1 (verde) de células asesinas naturales (natural killer cells, NK) cambiando de forma mientras ataca y aniquila células tumorales HT-29 marcadas con cetuximab (azul). La absorción de yoduro de propidio (YP) [rojo] es indicio de muerte celular.

Herramientas externas para supervisar el rendimiento del microscopio

Adicionalmente a las soluciones de microscopía integradas para supervisar el rendimiento, existen varias soluciones externas que pueden servir tanto a los usuarios de microscopios como a los fabricantes para garantizar el óptimo rendimiento del equipamiento microscópico. Argolight es una empresa especializada en soluciones de control de calidad para microscopios. La empresa ha diseñado una gama de portaobjetos para el control/aseguramiento de calidad y el software dedicado; con ellos es posible detectar incluso las pequeñas fluctuaciones en el rendimiento del microscopio.

Las soluciones de análisis del rendimiento de Argolight están disponibles en forma de portaobjetos o placas de micropocillos. Es posible usarlas en una amplia gama de sistemas microscópicos, como los microscopios de fluorescencia, para fines de control/aseguramiento de calidad. Estas soluciones representan un valioso punto de partida para los investigadores que tienen dudas en cuanto al rendimiento de su microscopio.

Figura 2. Los portaobjetos de Argolight HM llevan incorporados dos de los 16 patrones fluorescentes. Imagen de la izquierda: Campo de patrón de anillos para inspeccionar la planitud de las imágenes. Imagen de la derecha: Patrón (vertical) de líneas espaciadas de modo gradual para inspeccionar la resolución.

Pero, ¿cómo funcionan?

En pocas palabras, los portaobjetos contienen un diseño fluorescente geométrico altamente definido con una matriz de puntos focales (ejemplos esbozados en la Figura 2 de más arriba). Estos portaobjetos son procesados en imágenes y, a continuación, las imágenes son analizadas por el software. Es de destacar que el software detecta cualquier sesgo en el funcionamiento del microscopio y determina el grado de sesgo para cada uno de los parámetros. Si un valor se encuentra fuera del rango aceptable, determinado por el usuario, es posible enviar esta información al fabricante o a la instalación central en forma de un conciso informe de errores.

Agilice el diagnóstico y la solución de problemas de su microscopio para seguir por el buen camino

Las soluciones que permiten un control/aseguramiento de calidad rápido de los microscopios, como las que ofrece Argolight, pueden beneficiar tanto al usuario como al fabricante. Por ejemplo, digamos que usted detecta un problema con su microscopio. Enviar un informe de errores a nuestro equipo especializado de ingenieros de servicio les otorgará una ventaja inicial a la hora de solucionar su problema. El hecho de contar con este informe, permite localizar rápidamente un componente específico que pueda estar funcionando mal, así como formular preguntas más relevantes y específicas para ayudar a solucionar el problema.

El hecho de contar con un resumen sobre el rendimiento global del microscopio en un único informe, en lugar de tener que recopilar información a partir de una serie de herramientas analíticas independientes, puede suponer un ahorro de tiempo y dinero para el usuario. El ingeniero de servicio puede determinar rápidamente cuál es el problema para que los usuarios puedan volver a su trabajo. En efecto, disponer de un resumen detallado en un informe conciso aumenta la probabilidad de resolución del problema por parte de nuestros ingenieros de forma remota, lo que permite a los usuarios volver a sus investigaciones con un tiempo de inactividad mínimo de los instrumentos.

Ya hemos sido testigos de los beneficios que han obtenido muchos de nuestros clientes gracias a los instrumentos universales de diagnóstico y solución de problemas, los cuales garantizan la adquisición de datos fiables, eliminan el sesgo generado por el microscopio, muestran cómo evoluciona el rendimiento del sistema a lo largo del tiempo y les ayudan a sacar más partido a su microscopía cuantitativa.

¿Desea recibir asistencia con respecto al diagnóstico y la solución de los problemas de rendimiento de su microscopio en el análisis cuantitativo? Póngase en contacto con nuestro equipo especializado de atención al cliente aquí.

Si desea obtener más información sobre las soluciones de Argolight, puede ponerse en contacto con ellos aquí.

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