El procesamiento de imágenes de fluorescencia requiere actuar de manera equilibrada y minuciosa. Por un lado, se debe adquirir una señal lo suficientemente alta a través de un tiempo de exposición más largo o una luz de excitación más fuerte. Por otro lado, se tiene que reducir al mínimo la fototoxicidad para la condición de la muestra, y reducir el tiempo de excitación y la intensidad.
Descubra cómo lograr ese equilibrio a través de las prácticas recomendadas para las cámaras microscópicas.
1. Utilizar un histograma
Un histograma puede ayudarle a determinar el tiempo de exposición idóneo. En términos simples, un histograma sería como un gráfico que indica la distribución del nivel de la señal. El eje X del histograma es la intensidad de la señal. Los datos se distribuyen desde cero hasta el nivel de señal máximo de la cámara. La altura del histograma conforme a cada valor X muestra la cantidad de píxeles según la intensidad de la señal, tal como se expone en la figura 1 a continuación.
Figura 1: Histograma de una imagen. (a) Imagen original, (b) intensidad de la señal de cada píxel mostrado en la imagen original, (c) un histograma creado a partir de la imagen original.
La forma y distribución del histograma confirma si el tiempo de exposición aplicado es apropiado. En la mayoría de los procesamientos de imágenes con fluorescencia, la mayor parte de los píxeles presentan un fondo oscuro sin señales, lo que genera un pico alrededor del nivel de fondo.
Si el histograma se muestra demasiado lleno en una escala de señal baja, significa que el tiempo de exposición es demasiado corto (Figura 2, centro). Si se muestra una caída pronunciada en el nivel máximo de la señal, significa que el valor de la señal está saturado (Figura 2, derecha). En este caso, es posible reducir la intensidad de la excitación o acortar el tiempo de exposición.
Figura 2: Histograma con una exposición normal (izquierda), exposición insuficiente (centro) y exposición excesiva con saturación en el marcador amarillo (derecha).
2. Empareje el rango dinámico de visualización con el rango dinámico de datos
Algunos softwares de adquisición de imágenes cuentan con una función de ajuste de visualización automático que proporciona una visibilidad mejorada y mantiene los datos de la imagen original, además de definir una relación entre la intensidad de la señal y el brillo de la pantalla.
Emparejar el rango dinámico de visualización con el rango dinámico de los datos (el rango desde el nivel de fondo hasta la señal más brillante) permite obtener una mejor visibilidad, manteniendo los datos de la imagen original (Figura 3, derecha). Un histograma permite ilustrar este ajuste.
Figura 3: Ajuste de la visualización (a) Ajuste original. El brillo de la señal mostrada es mucho más tenue que el rango dinámico de visualización (255). (b) Condición de visualización ajustada.
Ya que se han explicado algunas herramientas microscópicas y ofrecido algunos consejos útiles, hay que ponerlos en práctica. La siguiente sección presenta un proceso de trabajo paso a paso para ayudarle a definir los ajustes de adquisición de imágenes más apropiados para el procesamiento de imágenes con fluorescencia.
Seis pautas para configurar los parámetros de adquisición de una cámara microscópica
Se proporcionarán seis pautas generales para configurar correctamente una cámara microscópica para un experimento de procesamiento de imágenes con fluorescencia. Tenga en cuenta que el mejor procedimiento depende de su aplicación específica y de las muestras.
- Determine la magnificación de la observación
- Ajuste el enfoque de su muestra y encuentre el objetivo de observación. Se recomienda usar el ajuste de visualización automática. Cierre siempre el obturador de fluorescencia mientras no está observando una imagen en vivo o captura una fotografía.
- Ajuste la configuración de la cámara para adquirir imágenes (p. ej., resolución, tiempo de exposición).
- Pruebe con la intensidad de luz más suave y después aumente el tiempo de exposición hasta que obtenga una señal más alta que el ruido de fondo.
- Si el tiempo de exposición es demasiado largo, intente paso a paso con una excitación un poco más fuerte.
- Revise el histograma para confirmar la ausencia de saturación.
Tenga en cuenta que esta es una lista resumida de las prácticas recomendadas. Para obtener instrucciones detalladas sobre el procesamiento de imágenes digitales, consulte nuestra documentación técnica Comprender la relación entre los datos de imagen digitales y las muestras biológicas.
Siempre tener en cuenta la muestra y la aplicación para el procesamiento de imágenes de fluorescencia
La mejor configuración de adquisición de imágenes depende en última instancia de su muestra y de la aplicación. Si su muestra es delicada, es posible que tenga que usar una excitación más suave. Por otro lado, aplicar una exposición más corta con una excitación relativamente fuerte podría funcionar mejor si tiene que capturar fenómenos rápidos. De cualquier forma, el histograma y el ajuste de visualización pueden ayudarle a determinar la condición de adquisición idónea.
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