Cortes organotípicos cerebelosos de murinos regenerados durante siete días tras la desmielinización. Los axones aparecen con el neurofilamento-H en verde, la mielina está marcada con la proteína básica de mielina en rojo y el gen GSTpi está marcado en azul con los cuerpos celulares de los oligodendrocitos. Muestras de Katherine Given, MS, Universidad de Colorado Denver. Captura ejecutada a 20X en el escáner de diapositivas de investigación SLIDEVIEW VS200 con el módulo SILA.
 

Los microscopios de fluorescencia de campo amplio ofrecen un procesamiento de imágenes de alta resolución para las muestras delgadas. Pero, cuando se trata de muestras más gruesas, los microscopios de campo amplio presentan una capacidad de procesamiento de imágenes limitada debido a la fluorescencia de fondo que provoca imágenes borrosas.

¿Pero cómo se elimina el desenfoque de la imagen en el caso de muestras más gruesas? La respuesta reside en el seccionamiento óptico. Este método supera eficazmente las limitaciones de las imágenes de campo amplio; pero, tradicionalmente ha requerido un sistema confocal o un software de supresión de desenfoque.

Hoy en día, la tecnología de seccionamiento óptico está disponible para los escáneres de portaobjetos dedicados a la investigación. Esto significa que los investigadores pueden beneficiarse de las capacidades confocales para procesar imágenes a partir de muestras gruesas con un rendimiento significativamente mejorado. En esta publicación, se exponen en detalle las ventajas de este método de seccionamiento óptico y se las compara con las técnicas tradicionales.

¿Cuáles son las limitaciones del procesamiento de imágenes de campo amplio para las muestras gruesas?

La microscopía de campo amplio es una técnica de procesamiento de imágenes común que resulta muy eficaz para muestras delgadas (<10 µm). En la microscopía de campo amplio, la cámara recoge la luz de los planos enfocados como de aquellos desenfocados. Esto no es un problema en el caso de las muestras delgadas. Al procesar imágenes provenientes de muestras más gruesas, esta ineluctable fluorescencia de fondo produce una imagen borrosa y un contraste deficiente que llega a ocultar las estructuras de interés.

La microscopía confocal y otros métodos de iluminación de escaneo pueden enfrentar este problema. Funcionan dando forma a la iluminación mediante un patrón fijo, que da como resultado una imagen seccionada ópticamente. Estos sistemas pueden producir excelentes imágenes bajo condiciones favorables. Sin embargo, portan un costo(e) significativo. También, dependen de cuán bien definidos y controlados están los patrones de iluminación en función de la muestra.

Un enfoque de iluminación diverso para las imágenes de muestras gruesas

Para restar importancia a los efectos de la fluorescencia de fondo en el contraste y la calidad de la imagen, no siempre se requieren patrones de iluminación bien definidos y controlados. Existe una técnica conocida como microscopía HILO, que usa patrones granulares (speckle) aleatorios para iluminar la muestra fluorescente. Los patrones speckle exhiben una intensidad granular con un contraste inherentemente alto, lo que hace que las imágenes de fluorescencia obtenidas a través de la iluminación granular (speckle) parezcan granulares tal como lo define su nombre. Esta granularidad proporciona contraste y una indicación directa de qué tan enfocada está la muestra.

Durante el procesamiento de imágenes HILO, se recopilan y procesan dos imágenes en bruto. La primera es una imagen de campo amplio regular con iluminación uniforme. A ella, se le aplica un filtro de paso alto para extraer la información de alta frecuencia: la parte «HI» de la microscopía HILO. Este paso elimina la información de baja frecuencia, como la información del enfoque y el desenfoque.

La segunda imagen es capturada usando la iluminación granular (o speckle) con el fin de recuperar la información de la imagen de enfoque de baja frecuencia. En otras palabras, la parte «LO» de la microscopía HILO. Estas imágenes son procesadas con un algoritmo que extrae información del enfoque y elimina la fluorescencia de fondo. Tras ello, las dos imágenes se fusionan (Figura 1) con el fin de adquirir una imagen dotada de la información que proviene de todo el rango de frecuencia, sin la luz desenfocada.

El dispositivo de seccionamiento óptico SILA es una solución de procesamiento de imágenes de alto rendimiento para nuestros escáneres de portaobjetos dedicados a la investigación SLIDEVIEW™ VS200 que se basan en la microscopía HILO. Representa una tecnología complementaria para microscopios de campo amplio que tiene como objetivo eliminar la luz desenfocada. Es de destacar que produce un seccionamiento óptico claro que equivale a la microscopía confocal. El dispositivo SILA puede integrarse fácilmente en cualquier sistema VS200. Ofrece ventajas para una amplia gama de aplicaciones que requieren un procesamiento de imágenes óptico de alta calidad para muestras más gruesas.

Figura 1. Sección de riñón de ratón en 20X. El dispositivo SILA del escáner VS200 combina una imagen iluminada uniformemente con una imagen iluminada con gránulos para ofrecer una imagen combinada con un corte óptico nítido.
 

Seccionamiento óptico regulable por medio de un parámetro

Puesto que el dispositivo SILA procesa matemáticamente la imagen de campo amplio tradicional y la imagen granular (speckle), es posible regular el nivel del seccionamiento óptico a través de un solo parámetro: el espesor de seccionamiento (sectioning thickness, ST). Cuando el parámetro ST se determina a alto, las imágenes muestran información a partir de una mayor profundidad de campo. Esto da la apariencia de una imagen de campo amplio.

La Figura 2 muestra una sección de cerebro adquirida con el parámetro ST determinado en el valor 5 (ST5). Si el valor ST se determina a un alto nivel, quedan muchas áreas desenfocadas. A medida que se reduce el valor ST, la imagen muestra información de una menor profundidad de campo. Por tanto, al observar la sección del cerebro capturada en ST2 y ST1, la información de enfoque permanece y los elementos desenfocados desaparecen.

La capacidad que posee para optimizar el seccionamiento óptico de esta manera permite visualizar diferentes profundidades mientras se elimina la fluorescencia de fondo. Esta característica del dispositivo SILA, dedicado al escáner VS200, es comparable a los sistemas microscópicos confocales, en los que cambiando el tamaño del estenopo se puede lograr un efecto similar.

Figura 2. Muestra de cerebro de ratón marcada con tdTomato y adquirida en 20X.
 

Supresión del desenfoque a partir de muestras gruesas: Procesamiento de imágenes usando SILA frente a otras técnicas Otras técnicas

Previo al desarrollo del dispositivo SILA, los escáneres VS200 presentaban una solución alternativa para eliminar la luz desenfocada a partir de las imágenes de campo amplio. Con el software de deconvolución TruSight™, es posible deconvolucionar imágenes mediante los algoritmos de iteración restringida (CI) 2D. Este método de software funciona bien para suprimir parte de la luz desenfocada. Sin embargo, no elimina tanta luz desenfocada ni proporciona una optimización a nivel del seccionamiento óptico, como el software y hardware combinados con el módulo SILA.

No obstante, la deconvolución proporciona una opción intermedia viable para visualizar muestras más delgadas donde el seccionamiento óptico SILA no esté disponible. En la Figura 3, se muestran las diferencias en términos de calidad de imagen entre las imágenes de campo amplio convencionales, las deconvolucionadas con la opción de software y aquellas tratadas con SILA.

Figura 3. Imagen de los intestinos de un Platelminto Planaria, Schmidtea Mediterranea. Azul: DAPI. Verde: Células internas del intestino. Rojo: Células externas del intestino. Muestras proporcionadas por Amrutha Palavalli, Departamento de Regeneración y Dinámica Tisular, Instituto Max Planck, Goettingen (Alemania).
 

Aplicaciones de procesamiento de imágenes con SILA: Desde capas celulares gruesas hasta muestras tisulares.

La tecnología de seccionamiento óptico SILA aporta un considerable valor añadido a muchas aplicaciones de investigación, especialmente a aquellas en donde se requiere el procesamiento de imágenes tanto de capas celulares gruesas y fijas como de muestras tisulares. Mediante funciones que optimizan el seccionamiento, además de suprimir el desenfoque y contraste de imagen, comparables a las de los microscopios confocales, SILA ofrece un procesamiento de imágenes de alta calidad con un rendimiento ampliamente mejorado.

La capacidad para procesar imágenes de muestras más gruesas es una ventaja en el procesamiento de imágenes neurocientífico, donde a menudo se requieren secciones de tejido grueso para preservar la morfología de la muestra. El procesamiento de imágenes de secciones del cerebro puede plantear desafíos. Es especialmente difícil debido a la propensión del tejido cerebral a producir un efecto de dispersión de luz.

Tradicionalmente, se requerían sistemas microscópicos confocales o bifotónicos para capturar una imagen de alto contraste y alta calidad. Sin embargo, estos sistemas requieren una cantidad de tiempo considerable para procesar imágenes de una zona tan grande como una sección del cerebro. El escaneo automatizado de portaobjetos, proporcionado por el sistema VS200 con el dispositivo SILA, permite que el procesamiento de imágenes a partir de muestras gruesas —sobre una gran área— sea mucho más rápido. El resultado son imágenes de alta calidad en una fracción de tiempo (Figura 4).

Figura 4. Sección de cerebro de ratón de 200 μm. Vista sinóptica adquirida en 4X. El escaneo detallado es una imagen focal extendida (EFI) de una serie en Z de 47 μm adquirida en 20X. Azul: DAPI. Verde: GFAP (glía). Amarillo: MAP2 (neuronas).
 

La investigación de organoides es otra área que se beneficia de del procesamiento de imágenes con SILA, ya que las imágenes de organoides presentan complejidades similares a las de neurociencia. El procesamiento de imágenes de organoides es un desafío debido al espesor de dichas muestras, ya que es necesario adquirir imágenes a partir de áreas extensas para poder analizar adecuadamente su morfología.

Siendo un escáner de portaobjetos completos, el sistema VS200 con el módulo SILA proporcionan la cobertura necesaria para obtener imágenes de estas muestras de gran tamaño. Mientras tanto, el procesamiento automatizado de imágenes, la función de dispersión de puntos independiente de la muestra (PSF) y el flujo de trabajo simple que ofrece dan como resultado una rápida adquisición de imágenes. El dispositivo SILA también aporta valor a la investigación del cáncer, la biología espacial, la botánica, la embriología y muchas otras aplicaciones que requieren un procesamiento de imágenes de alta calidad a partir de muestras gruesas sobre áreas extensas.

Conclusiones clave acerca del procesamiento de imágenes SILA

El procesamiento de imágenes con SILA favorece la optimización del seccionamiento óptico, reduce el desenfoque de la muestra y mejora el contraste de la imagen de manera comparable a los sofisticados microscopios confocales de escaneo láser. Al brindar un rendimiento significativamente mejorado frente a los sistemas confocales, el escáner de portaobjetos VS200 —en conjugación con el dispositivo SILA— permite procesar imágenes a partir de muestras grandes y generalmente difíciles de obtener, lo que aporta importantes beneficios a la neurociencia, la investigación de organoides y muchos otros campos.

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