El procesamiento de imágenes multimodo y la multiplexación de fluorescencia han pasado a ser los métodos más usados para examinar los diversos elementos de las muestras, de forma eficaz, en un experimento. No obstante, los resultados cuantitativos de este experimento se basan en una capacidad: la extracción de datos de imagen profusos.
La importancia del procesamiento de imágenes de portaobjetos completo en la cuantificación
El principio básico del procesamiento de imágenes de portaobjetos completo es juntar de forma digital imágenes de gran aumento con un pequeño campo de visión dentro de una vista general más grande que la muestra. ¿Para qué sirve?
En términos simples, este procesamiento de imágenes de portaobjetos completo, a menudo conocido como procesamiento de imágenes de portaobjetos digital o microscopía virtual, proporciona un contexto biológico más completo de una imagen microscópica. La visualización de una o dos células aisladas con una gran magnificación puede proporcionar información, pero la colocación de esa célula en el contexto más amplio de los tejidos completos puede ofrecer una nueva dimensión de investigación.
Entonces, ¿por qué no capturar una imagen macrométrica del tejido? El poder del procesamiento de imágenes de portaobjetos completo es su visualización de macro a micro, en la que la resolución microscópica permite una mayor cuantificación de las imágenes, ya sea para contar los núcleos en un tejido o para trazar los axones en grandes distancias del cerebro.
Gracias a esta potente combinación de resolución y contexto biológico, el automático procesamiento de imágenes de portaobjetos completo ha pasado a ser un pilar imprescindible para muchos programas de investigación. Continúe su lectura para descubrir más sobre las potentes capacidades de observación que permiten extraer nueva información de las muestras.
Capacidades de procesamiento de imágenes en sistemas de escaneo automático de portaobjetos completo
Durante muchos años, los sistemas de procesamiento de imágenes de portaobjetos completo se limitaron sus modos de procesamiento de imágenes. Hoy en día, los sistemas de procesamiento de imágenes de portaobjetos completo, como nuestro Escáner de portaobjetos dedicado a la investigación VS200, puede combinar diversos métodos de observación para ver estructuras que solo son visibles bajo condiciones específicas. Esto significa que es posible combinar métodos de observación como:
- Campo claro: En el procesamiento de imágenes de campo claro, la luz blanca transmitida pasa por la muestra y los tejidos se visualizan por medio de colorantes cromogénicos. Cabe agregar que el campo claro no proporcionará un contraste innato a no ser que se utilicen colorantes cromogénicos, como la hematoxilina o la eosina.
- Epifluorescencia: Permite marcar algunos anticuerpos específicos y proporciona niveles más altos de focalización molecular. También permite superponer un número superior de colorantes para expandir el campo de la multiplexación.
- Contraste de fase y polarización: La fase y la polarización pueden incluirse en imágenes de portaobjetos completos para obtener diversos niveles de contraste basados en la luz polarizada o la iluminación de anillo de fase.
- Campo oscuro: Utiliza las diferencias en el índice de refracción de las estructuras membranosas del tejido. Aunque es posible usar algunos colorantes para acentuar el campo oscuro, la técnica puede obviar completamente el marcado y ofrecer un nivel de contraste que es comparable a la fluorescencia. Sin embargo, este modo de observación puede ser sensible al polvo.
Imagen de testículo en Permount, sin tinción, capturado con un objetivo de 20x. Campo claro (arriba izquierda), fluorescencia (arriba derecha), campo oscuro (abajo izquierda) y polarización (abajo derecha). Datos de imagen por cortesía de Robin Wacker, Günthersleben, Alemania.
Pero eso no es todo, los últimos escáneres de portaobjetos virtuales incorporan otras herramientas de procesamiento de imágenes para permitirle extraer mejores datos de los experimentos. Por ejemplo, nuestro escáner de portaobjetos VS200 puede enfocar varios planos del tejido para:
- Adquirir planos múltiples con una resolución más alta
- Visualizar muestras de hasta 100 µm de espesor
- Capturar imágenes usando todos los métodos de observación disponibles
- Obtener fácilmente información de todas las dimensiones de la muestra
- Calcular proyecciones (deconvolución, Z máxima o EFI)
El apilamiento en Z puede adquirir hasta 35 planos con la resolución más alta, los que facilita la obtención de información a partir de todas las dimensiones de la muestra.
Otra herramienta útil es el mecanismo de suministro automático de aceite, que ayuda a que el sistema alcance la resolución más alta.
La combinación de estos modos y estas funciones de procesamiento de imágenes resulta todavía más potente si se usan con la especificidad molecular alcanzada por las técnicas de marcado de anticuerpos. No obstante, puede que siga siendo complicado marcar de forma eficaz y cuantitativa con fluorescencia.
Teniendo eso en cuenta, la siguiente sección abordará las tecnologías de procesamiento de imágenes que pueden ayudar en las aplicaciones de multiplexación de fluorescencia.
Principios tecnológicos para la multiplexación de tejido
La multiplexación de fluorescencia se ha convertido en una herramienta muy útil en la investigación inmuno-oncológica debido al microentorno increíblemente complejo de los tumores; sin embargo, es necesario contar con softwares, personal y equipos especializados para poner en práctica un ensayo y aplicarlo al tumor de interés.
Los fabricantes han desarrollado nuevas tecnologías que cubren las diversas necesidades y los problemas más comunes que antes no podían ser usados de forma generalizada para este tipo de ensayo. Estos parámetros tecnológicos son:
Multiplexación de alto nivel que solucione los siguientes problemas:
| Compatibilidad de flujo de trabajo que ofrezca:
|
Procesamiento de imágenes de portaobjetos completo que capture:
| Un software que pueda identificar fenotipos complejos:
|
Repaso de un ensayo con el marcador de multiplexación UltiMapper™
Otra tecnología útil para los experimentos de procesamiento de imágenes de multiplexación es el ensayo de secuencia I-O UltiMapper.
Los ensayos de secuencia I-O UltiMapper emplean la tecnología InSituPlex® para permitir la multiplexación del portaobjetos completo con alta resolución en el caso de un fenotipo celular y perfil especial de la actividad del biomarcador. Como solución preoptimizada con reactivos, estos kits se integran fácilmente en el software y los equipos existentes de todo el flujo de trabajo de inmuno-histoquímica (IHC) y permite a los investigadores pasar de la coloración a la adquisición y evaluación de las imágenes en tan solo un día.
La siguiente imagen muestra el proceso simple de cuatro pasos:
Paso 1: Recuperar
- Se desparafina y recuperan las muestras normalmente.
Paso 2: Teñir
- Se incuba la muestra con una mezcla de anticuerpos, dotada de un código de barras, en un único paso de tinción.
- Secuencia de ADN única (código de barras) adherida a cada anticuerpo.
Paso 3: Amplificar
- Se amplifican todos los objetivos simultáneamente.
- Se aumenta el índice de códigos de barras por anticuerpo, lo que permite asociar más cadenas de la sonda complementaria.
Paso 4: Detectar
- Se añaden sondas de ADN complementarias para asociar objetivos.
- A partir de ese momento, las muestras están listas para el procesamiento de imágenes.
- Tecnología de hibridación del ADN
Tres factores que afectan a la calidad de imagen en la cuantificación
A la hora de elaborar su experimento, tenga en cuenta que la combinación adecuada de tecnologías ópticas y de tinción le permitirá obtener el mejor análisis posterior. Al intentar analizar imágenes de baja calidad provenientes un kit de reactivos erróneo, una configuración óptica no apropiada o una configuración de adquisición equivocada, no logrará un buen análisis.
A continuación, se explican los tres factores ópticos que afectan la calidad de imagen para la cuantificación:
- Color de iluminación preciso:Es importante tener una representación del color verdadera y reproducible en la tinción con hematoxilina-eosina. La óptica transmitida debería tener características espectrales que simulen las fuentes de luz halógenas para poder reproducir los colores violeta, cian y rosa.
El LED True color del sistema VS200, dedicado a la iluminación transmitida, se dota de las mismas características espectrales y potencia de una lámpara halógena, de manera que las tinciones de color morado, cián y rosado son procesadas, generadas y representadas correctamente.
- Precisión y fidelidad del color: Además de tener las características espectrales de iluminación adecuadas, la cámara microscópica debe tener una fidelidad del color excelente y una precisión extraordinaria. No olvide usar una cámara con corrección del color y el equilibrio adecuado para poder representar el tejido de forma precisa. La medición de las imágenes digitales puede resultar objetiva porque los distintos ajustes de adquisición generan resultados de imágenes diferentes, pero las cámaras con corrección del color y perfiles ICC replican a la perfección los niveles de color e intensidad en las pantallas de los PC.
La medición de las imágenes digitales puede resultar objetiva porque los distintos ajustes de adquisición generan resultados de imágenes diferentes. El escáner VS200 usa cámaras con corrección del color y proporciona perfiles ICC para una excelente reproducción de colores e intensidades en los monitores de los ordenadores.
- Planitud de campo: En una serie de imágenes en las que el campo no es plano o donde no viene integrada una función de corrección, puede aparecer un efecto de halo en todos los campos de visión y ello dificulta la cuantificación. En este caso, debe usar un efecto de filtrado y equilibrio no lineal de todos los campos de visión, lo que consume mucho tiempo y recursos. Considere la configuración óptica que le ayudará a maximizar la planitud del campo para poder conseguir un resultado cuantitativo mejorado.
Los objetivos X Line™ de alto rendimiento incorporados en el escáner de investigación VS200 ayudan a mejorar la planitud de imagen.
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Gracias a que las imágenes pueden adquirirse en masa con un apilamiento en Z múltiple, es posible mejorar y acentuar el contraste de las imágenes con métodos como la deconvolución, proyecciones de intensidad máxima o vistas de enfoque extendido, a fin de poder seleccionar el mejor enfoque para la imagen.
En última instancia, la solución para el análisis cuantitativo es una combinación de un buen marcado, una buena óptica y un software que resista el análisis de segmentación, recopilando información estadística que es relevante a nivel biológico.
Para obtener más información sobre la extracción de datos profusos a partir de sus experimentos de multiplexación de fluorescencia y procesamiento de imágenes multimodo, visualice aquí el Seminario web por solicitud.
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