Métodos de detección en microscopía confocal
La microscopía confocal es una técnica clásica usada para estudiar la expresión de proteínas y las interacciones en muestras de tejido grueso. A diferencia de la microscopía de epifluorescencia de campo amplio, que capta los fotones emitidos a partir de todo el campo de visión (incluidos los fotones fuera del plano focal), la microscopía confocal usa un estenopo que se conjuga con el plano focal para rechazar la luz desenfocada y crear una imagen seccionada por la óptica de sólo el plano tisular enfocado.
El método confocal es eficaz para obtener imágenes nítidas y de alta resolución a partir muestras gruesas, pero la pérdida de luz inherente del estenopo hace que sea difícil capturar imágenes con una óptima relación señal-ruido. Debido a ello, es fundamental asegurarse de que los componentes restantes del tren óptico del microscopio sean altamente eficientes para minimizar la exposición requerida al láser que genera una imagen y captar la mayor cantidad posible de fotones emitidos.
Diferencias entre las técnicas de detección de luz espectral y de filtro
Cuanto se trata de una detección basada en filtros, se coloca un filtro de paso de banda frente al tubo fotomultiplicador (PMT) para seleccionar las longitudes de onda de luz que deberán ser captadas por su detector. En cambio, en la detección espectral, se usa una red (también denominadas retícula/rejilla) o un prisma para crear un espectro de la luz emitida, lo que le permite sintonizar con precisión la banda o las bandas del espectro de emisión que se desea(n) detectar.
Esta última detección también permite «escaneos lambda», a partir de los cuales se genera el perfilado completo del espectro de luz emitida en anchos de banda y tamaños de paso específicos.
Si bien los métodos de detección espectral permiten experimentos más flexibles, tradicionalmente son vistos como una solución intermedia de compensación en términos de sensibilidad. La detección basada en espectros proporciona una mayor flexibilidad, pero la detección basada en filtros suele ser más eficiente.
Orígenes de la espectroscopia en microscopía
Para crear un espectro, la tecnología de detección espectral se ha basado en dos métodos: el sistema de red (tb. retícula/rejilla) de difracción de tipo reflexión y el sistema basado en prismas. La tecnología de reflexión se ofreció por primera vez a través del primer microscopio confocal disponible a nivel comercial hacia fines de la década de 1990 (Figura 1). Poco después, se lanzó un sistema confocal basado en prismas.
De acuerdo con lo anterior expuesto, los métodos de detección espectral tienden a ser menos eficientes que los métodos basados en filtros. Y, existen tres factores que destacan las diferencias de eficiencia:
- Pérdida de difracciones del orden superior: Cuando la luz se refleja a partir de una red de difracción, se crean varios órdenes de difracción. Dado que solo el primer orden de difracción atraviesa la trayectoria de detección, los órdenes superiores de difracción se pierden.
- Pérdida por causa de la polarización: La reflectancia de la luz difiere según el estado de polarización, lo que produce una eficiencia de difracción de la luz polarizada P inferior a la de la luz polarizada S en las retículas (redes) de reflexión.
- Eficiencia de la red de reflexión dependiente de la longitud de onda: La eficiencia de difracción alcanza un nivel máximo frente a una determinada longitud de onda, y la eficiencia frente a longitudes de onda más altas o más bajas es peor.
Las redes de difracción de tipo reflexión se ven afectadas por estos factores, lo que conlleva a categorizarlas como el método menos eficaz de la detección espectral. Los métodos de detección basados en prismas superan el problema de la pérdida de luz de difracción de orden superior, pero la resolución espectral se ve afectada con longitudes de onda más largas. Debido a estos inconvenientes, ninguna tecnología ha podido reemplazar completamente la necesidad por los sistemas de detección basados en filtros.
Figura 1: Cronología de la microscopía confocal y las tecnologías de detección espectrales
Holograma de fase de volumen: Un enfoque distinto a las redes
Durante casi dos décadas, las redes (también denominadas retículas/rejillas) de difracción de tipo reflexión y las tecnologías basadas en prismas han impulsado la mayoría de las aplicaciones de espectrología que se hallan hoy en los microscopios confocales de todos los fabricantes. Sin embargo, la microscopía no es el único campo que se basa en la espectroscopia como medio de creación de imágenes, sino que la astronomía también lo hace. La espectroscopia en astronomía es similar a la de la microscopía, ya que los objetos astronómicos de interés (como las galaxias y otros cuerpos celestes) también emiten luz desde el ultravioleta al infrarrojo; por lo tanto, los astrónomos necesitan poder diferenciar estos componentes de la luz para construir imágenes precisas de ellos (Figura 2).
Figura 2: Aplicación de la espectroscopia en astronomía para construir una imagen de una galaxia.
Créditos: NASA, ESA, Dan Maoz [Universidad de Tel Aviv (Israel) y Universidad de Columbia (EE. UU)]
La tecnología usada por los astrónomos para llevar a cabo dicho trabajo es el holograma de fase de volumen (VPH). En lugar de reflejar la luz a partir de una red de relieve superficial para producir un espectro de luz, las redes VPH utilizan un enfoque transmisivo, que pasa la luz a través de una red para difractar la luz incidente en sus componentes espectrales (Figura 3). Los experimentos astronómicos que utilizan el VPH se publicaron por primera vez alrededor del año 2000 y la tecnología fue adoptada rápidamente. Desde entonces, se han implementado con éxito redes de VPH a gran escala en espectroscopia dentro de algunos de los laboratorios más grandes del mundo.
Figura 3: Diagramas transversales de los mecanismos de difracción por redes de relieve superficial y redes holográficas de fase volumétrica Las redes de relieve superficial (a la izquierda) reflejan la luz a partir de la superficie de la retícula, mientras que las redes del VPH (a la derecha) transmiten la luz a través de la retícula.
En el año 2016, la tecnología del VPH fue implementada por primera vez en un microscopio comercial a través del lanzamiento del microscopio confocal FLUOVIEW ™ FV3000 con la tecnología de detección TruSpectral™, que usa un VPH para habilitar la difracción de luz por transmisión. Entre las ventajas que proporciona el uso de las redes del VPH en la microscopía, destacan:
- Sensibilidad de polarización baja
- Dispersión baja (alta eficiencia)
- Alta transmisión en todo el espectro (especialmente en el rojo a diferencia de las redes de difracción de tipo reflexión)
- Mayor flexibilidad a diferencia de los filtros
Debido al uso de redes de difracción de tipo transmisión, la tecnología TruSpectral supera muchos de los desafíos típicamente asociados a los métodos convencionales de detección espectral. Por ejemplo, su pérdida causada por la polarización es mínima en comparación con la pérdida significativa que ocurría típicamente con las redes de difracción de tipo reflexión. Asimismo, la tecnología VPH elimina la dependencia provocada por la longitud de onda en la eficiencia de la difracción. Las redes de reflexión tienen un ángulo fijo, por lo que sólo pueden optimizarse para una longitud de onda, mientras que el ángulo del VPH puede ser controlado para optimizar la eficiencia en cualquier longitud de onda de detección. Esto permite una mayor eficiencia de transmisión en todo el espectro, particularmente en longitudes de onda más largas.
¿Cómo funcionan las redes VPH en el microscopio FV3000?
El uso del VPH a través de nuestra tecnología de detección TruSpectral para el microscopio confocal FV3000 se basa en tres características clave (Figura 4):
- Un ajuste de ángulo motorizado del VPH para optimizar de forma automática su ángulo en las longitudes de onda de la luz bajo detección.
- Un espejo lambda motorizado y ajustable, que se usa para orientar regiones específicas del espectro producido por el VPH al PMT.
- Una ranura motorizada y ajustable justo en frente del PMT, que puede determinarse con total libertad de 1 nm a 100 nm y en tamaños de paso intermedios de 1 nm.
Juntas, estas características permiten la detección espectral lineal de alta resolución de 400 nm a 800 nm.
Figura 4: Diagrama del sistema de detección TruSpectral basado en el VPH del microscopio confocal FV3000
Beneficios de la detección TruSpectral en la adquisición de imágenes de fluorescencia con tinción roja
El VPH no solo proporciona una mayor flexibilidad, sino también una mejora significativa en la eficiencia de transmisión del sistema de detección, particularmente en la ventana objetivo de rojo a rojo lejano (Figura 5).
Las tinciones de corrida (acercamiento) al rojo son cada vez más populares para aplicaciones de procesamiento de imágenes, ya que la luz corrida al rojo es menos fototóxica, permite una mejor penetración tisular en profundidad y amplía las capacidades de multiplexación. Sin embargo, los fluorocromos rojos a menudo son difíciles de captar con tecnologías tradicionales de procesamiento de imágenes basadas en espectros; esto se debe a la baja eficiencia de transmisión y resolución espectral de las redes y prismas de difracción de tipo reflexión. La detección espectral basada en el VPH no solo permite una mayor transmisión de luz roja, sino que conserva la precisión y resolución del espectro resultante, lo que permite una resolución espectral precisa de 1 nm a 800 nm.
Figura 5: Comparación de la eficiencia de transmisión entre la tecnología de detección TruSpectral basada en el VPH con el microscopio FV3000 y la redes de difracción basadas en la reflexión con en el microscopio FV1200. El uso de redes VPH da como resultado una transmisión hasta tres veces mayor en comparación con los métodos tradicionales de detección espectral.
Las mejoras viabilizadas por la red VPH han permitido diseñar y construir a Olympus el microscopio FV3000 como un sistema completamente espectral, lo que significa que cada detector usa la tecnología de detección TruSpectral basada en el VPH tal y como se muestra en la Figura 4. Un sistema completamente espectral con canales independientes le permite omitir la mezcla de múltiples señales de intensidad variable a fin de detectar de forma simultánea la fluorescencia brillante y tenue (Figura 6).
Figura 6: «Escaneo espectral lambda» de las células COS-7 mostrando una clara separación de las señales muy superpuestas
Desde la astronomía hasta la microscopía, las retículas (también denominadas redes/rejilals) del VPH están demostrando ser una herramienta poderosa para experimentos de espectroscopia. No se pierda el próximo destino tecnológico.
Figura 7: Aplicaciones espectroscópicas comparadas en la astronomía y en la microscopía. Arriba: Separación espectral de la luz emitida por diferentes cuerpos celestes dentro de una galaxia. Abajo: Separación espectral de cuatro estructuras diferentes dentro de una celda. Créditos de las imágenes principales: NASA, ESA, Dan Maoz (Universidad de Tel Aviv, Israel y Universidad de Columbia, EE. UU)
