Observación de un esferoide tumoral vascularizado en un chip con un microscopio confocal

Los estudios muestran que los tumores inducen el crecimiento de los vasos sanguíneos para reforzar una actividad tumoral vigorosa. Estos vasos sanguíneos actúan como sustento para el tumor y juegan un papel importante en su microambiente (TME, tumor microenvironment) a fin de reforzar su actividad. Hasta ahora, las respuestas de los tumores a los estímulos bioquímicos y biomecánicos han sido evaluadas bajo condiciones estáticas y no incluyen los efectos del flujo sanguíneo en dichos tumores. En este estudio, se presentará una plataforma de chip para tumores, que permite la evaluación del microambiente tumoral con flujo de medios a través de una red vascular perfusible y mide los efectos de la administración de drogas en el flujo sanguíneo.

Observación 3D del esferoide tumoral en el dispositivo microfluídico

Figura 1. Dispositivo microfluídico y modelo de tumor.
Imagen del dispositivo microfluídico (izq.), modelo de tumor con una red vascular perfusible (dcha.).

En este estudio, se repasará el microambiente tumoral, como también la red vascular, mediante el cocultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con esferoides provenientes de líneas celulares de adenocarcinomas mamarios de humano (MCF-7) en dispositivos microfluídicos. Para confirmar que una red vascular sea perfusible en el dispositivo microfluídico, se observó con el microscopio confocal FV3000RS si las esferas fluorescentes (verdes) pasan continuamente a través de la red vascular y el esferoide. Las muestras cultivadas en 3D son difíciles de visualizar debido al grosor de la masa. Para producir una señal fluorescente fuerte que pueda ser detectada suele necesitarse una intensidad alta de la luz de excitación. Sin embargo, la luz de excitación más alta también aumenta la fototoxicidad y provoca daños a las células. Para superar esta complejidad, se utilizó el microscopio confocal FV3000, que alberga la tecnología de detección TruSpectral de Olympus y detectores GaAsP de alta sensibilidad, con el fin de capturar señales fluorescentes débiles y minimizar la potencia del láser.

Figura 2. Esferoide tumoral y red vascular.
Núcleo： cian （405 nm, Hoechst 33342）, RFP-HUVEC： magenta （561 nm, RFP）, E-cadherin： amarillo（640 nm, Alexa Fluor 633）.
(a) Proyección del esferoide tumoral. Barra de escala: 200 μm; objetivo： UPLSAPO10X2.
(b) Imagen de 3 planos (x-y、x-z、y-z) de marco blanco en (a). Barra de escala: 20 μm, objetivos： UPLSAPO40X2.

Procesamiento de imágenes del flujo sanguíneo con el escáner resonante

También, se examinó el flujo en la red vascular del esferoide tumoral utilizando microesferas fluorescentes (verde, diámetro: 3,1 μm). Al observar el flujo sanguíneo rápido, la velocidad de exploración normal del galvanómetro puede que no sea suficiente. En este experimento, las imágenes fueron capturadas con el microscopio confocal Olympus FV3000RS equipado con un escáner resonante de alta velocidad. Se confirmó que al inyectar microesferas fluorescentes en el canal 3 del dispositivo microfluídico, las microesferas pasaron a través de las estructuras lumínicas del esferoide y alcanzaron el canal 1, lo que indica la capacidad perfusible de la red vascular creada. Después de haber confirmado la validez de este modelo de esferoides tumorales creados para estudiar los efectos del flujo sanguíneo en el microambiente del tumor, se esclareció en experimentos posteriores que la eficacia de los medicamentos en el TME, incluida la red de vasos sanguíneos, varía en función de la presencia o ausencia de flujo intravascular. Se espera que nuestro modelo tridimensional pueda en el futuro contribuir al desarrollo de drogas como un modelo en la administración de drogas transvasculares.

Video: Flujo de esferas fluorescentes dentro de los vasos sanguíneos y esferoides tumorales creados en un dispositivo microfluídico.
Condición de la imagen: 65 ｍs/fotograma. Barra de escala: 100 μm.

Comentario del Dr. Yokokawa

Lo novedoso de este estudio fue la creación de una red vascular perfusible en un esferoide tumoral. Era importante visualizar cómo la red vascular conecta el esferoide y los canales microfluídicos. Además, era esencial observar simultáneamente el lumen vascular y el flujo a través de la vascularización (o vasculatura) para demostrar la capacidad perfusible. El escáner resonante de alta velocidad, acoplado al microscopio confocal FV3000, permitió la obtención de imágenes provenientes de la red vascular (marcada con RFP) y el flujo dinámico de microesferas (verde).

Reconocimientos
Esta nota de aplicación ha sido preparada con la ayuda de los siguientes investigadores.
Departamento de Microingeniería, Universidad de Kioto¹
Frontier Research Institute para Ciencias Interdisciplinarias (FRIS), Universidad de Tohoku²

Referencias
Nashimoto Y, Okada R, Hanada S, Arima Y, Nishiyama K, Miura T y Yokokawa R. Biomateriales. 2020, Enero; 229:119547. "Vascularized cancer on a chip: The effect of perfusion on growth and drug delivery of tumor spheroid.” [Cáncer vascularizado en un chip: El efecto de la perfusión en el crecimiento y la administración de drogas en el esferoide tumoral]. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.119547

¿Cómo el microscopio confocal FV3000 favoreció a nuestro experimento?

Completo sistema espectral con detectores GaAsP de alta eficiencia que proporciona alta sensibilidad en el procesamiento de imágenes de células vivas

La serie de microscopios confocales FV3000 incorpora la tecnología de detección TruSpectral de Olympus, que difracta la luz por medio de la transmisión a través de la unidad de holograma de fase de volumen. Esta tecnología proporciona una emisión de luz mucho mayor que la de las unidades de detección espectral convencionales con rejillas de tipo reflexión. El detector espectral de alta sensibilidad (HSD) de dos canales del microscopio FV3000 emplea la tecnología TruSpectral con GaAsP PMT y refrigeración de efecto Peltier para lograr una eficacia cuántica alta del 45 % con una alta relación entre señal y ruido. Esta combinación de tecnologías de detección permite una detección potente, de alta sensibilidad, y minimiza la potencia láser necesaria para realizar una observación del tejido vivo.

Dos opciones de escáner