¿Cómo la microscopía de polarización nos permite entender los materiales que forman nuestro tejido óseo?

Introducción

La microscopía de polarización es una técnica óptica avanzada que aumenta el contraste en muestras birrefringentes. Permite obtener diferentes perspectivas a partir de la estructura y composición de una amplia variedad de materiales orgánicos e inorgánicos.

Existen dos tipos de microscopía de polarización que se aplican comúnmente: la polarización lineal y la polarización circular. Tal como su nombre lo especifica, la microscopía de polarización lineal usa luz polarizada de forma lineal para iluminar una muestra. Por otra parte, la microscopía de polarización circular emplea la luz polarizada de forma circular, lo que la hace especialmente sensible a la simetría (orientación izquierda o derecha) de las estructuras internas de una muestra. Estas técnicas son usadas en los campos de la biología, ciencia de los materiales y geología para examinar estructuras y propiedades microscópicas de varios materiales.

A través de esta nota de aplicación, se examinan en detalle estas técnicas ópticas de polarización y se muestra cómo la microscopía de polarización circular permite una mejor visualización de los materiales birrefringentes.

Componentes birrefringentes en el tejido óseo

La birrefringencia es la propiedad óptica de un material que consiste en desdoblar un rayo de luz incidente en dos rayos distintos cuando éste atraviesa el material. La piel, la córnea, los tendones, los ligamentos, los tejidos musculares, los cartílagos y los huesos son todos tejidos y órganos que generan birrefringencia debido a sus estructuras anisotrópicas organizadas (propiedades ópticas que no son uniformes en todas las direcciones). La birrefringencia tiene efectos en la forma que los materiales de tejido óseo —como los huesos y cartílagos— interactúan con la luz polarizada.

Los huesos de los mamíferos y las aves son materiales rígidos, hechos principalmente de colágeno y fosfato de calcio. Los cuatro tipos de células óseas son:

1. Osteoblastos — células encargadas de la síntesis de la porción orgánica de la matriz ósea (formación de hueso).
2. Osteocitos — osteoblastos inactivos que se encargan del mantenimiento de la matriz ósea, localizados en espacios llamados lagunas.
3. Osteoclastos — células que tienen como función primaria la remodelación ósea.
4. Las células osteogénicas u osteoprogenitoras son células madre no especializadas que dan origen a los osteoblastos.

El cartílago trabaja de forma conjuntiva/conectiva con el hueso para crear lo que se conoce como tejido óseo. Este tejido conjuntivo y especializado es flexible y a la vez resistente. Los tres diferentes tipos de cartílago son:

1. Cartílago hialino — es el que más abunda en el cuerpo, como en la nariz, costillas, tráquea, laringe, bronquios y superficies articulares del hueso. Juega un papel importante durante el desarrollo y crecimiento embrionario, ya que forma la estructura ósea del feto y la placa epifisaria responsable del crecimiento longitudinal del hueso.
2. Fibrocartílago — es un tejido intermedio entre el cartílago y el tejido conjuntivo denso. Se localiza en los discos intervertebrales y articulaciones, como en la sínfisis púbica.
3. Cartílago elástico — tiene abundantes fibras elásticas en la matriz. Se localiza en la oreja, la epiglotis y algunas secciones de la laringe.

Muchas sustancias tienen efectos en la salud de los huesos y cartílagos. La más conocida es la vitamina C (ácido ascórbico). A través de investigaciones, los científicos han demostrado que la vitamina C es un nutriente esencial que permite formar —entre otras estructuras— el colágeno de los huesos y puede inducir la expresión génica ósea en los osteoblastos. Con respecto al cartílago, la vitamina C actúa como agente reductor de la osteoartritis o artrosis (una enfermedad que degenera de forma gradual y dolorosa el cartílago de las articulaciones), ya que estimula la síntesis del colágeno.

¿Cómo se entiende la microscopía de polarización lineal y circular?

Para capturar imágenes con una calidad elevada a partir de los huesos, cartílagos, vitamina C y otros materiales birrefringentes con la microscopía polarizada, es importante comprender como primer paso los métodos de luz polarizada tanto lineal como circular.

Las fuentes de luz generan luz no polarizada, que vibra en todos los ángulos de 360°. Cuando la luz no polarizada pasa a través de un polarizador, ésta se convierte en una luz polarizada lineal. La luz polarizada de forma lineal atraviesa la muestra. Si la muestra es isotrópica (propiedades ópticas uniformes en todas las direcciones), no afectará la luz polarizada, y la luz permanecerá en el mismo estado de polarización. Por el contrario, si la muestra es anisotrópica, habrá un cambio en la polarización de la luz a medida que ésta atraviesa por la muestra. Este cambio en la polarización permite que la luz atraviese hasta un analizador, el cual está orientado perpendicularmente hacia el polarizador.

El inconveniente de la polarización lineal es que genera figuras de interferencia uniaxial, bandas oscuras en un patrón cruzado maltés (cruz formada por brazos en formas de V) que aparecen en el campo visual. Esto sucede cuando la muestra procesada en imagen presenta una simetría radial, lo que causa la división de la luz polarizada alrededor del centro radial y crea luz que no puede pasar a través del analizador. El patrón cruzado maltés causa una reducción de la intensidad; por tanto, afecta el uso de las imágenes para la cuantificación o el análisis.

La polarización circular no presenta este inconveniente. Además, usa un polarizador que convierte la luz ordinaria en luz vibratoria a través de un único plano (luz polarizada de forma lineal). Sin embargo, con la polarización circular, un material birrefringente, como una placa de cuarto de onda, se ubica en un ángulo de 45° con respecto al polarizador en la trayectoria de la luz polarizada. La luz experimentará un desplazamiento de fase, que es la diferencia de tiempo recorrido por las ondas de luz cuando atraviesan el material. Esto da como resultado una luz con un campo circular rotativo. Cuando la luz circular rotativa pasa a través de la muestra, se refracta en todas las posiciones rotativas de 360°. Al ubicar una segunda placa de cuarto de onda en un ángulo de 90°, desde la primera placa, a través de la trayectoria de la luz refractada, el efecto se elimina. Esto crea nuevamente una luz polarizada lineal, la cual se abre paso a través del eje de transmisión del analizador. Cabe resaltar que las dos placas de cuarto de onda están giradas a un ángulo de 45° con respecto al polarizador, pero en direcciones opuestas.

Figura 1. Cristales de la vitamina C procesados en imagen con microscopía de polarización a) lineal y b) circular usando el escáner de portaobjetos dedicado a la investigación SLIDEVIEW™ VS200 de Evident y el objetivo MPLFLN40X (A. N. de 0.75). (a) Con la polarización lineal, se ven las figuras de interferencia uniaxial (bandas negras). (b) Con la polarización circular, en la misma muestra, no se ven estos efectos de distorsión (artefactos).
 

Procesar imágenes de los huesos, los cartílagos y de la vitamina C con microscopía de polarización

La vitamina C, conocida como ácido ascórbico, es una molécula quiral. Cuando la luz polarizada pasa a través de los cristales de la vitamina C, la quiralidad de la molécula provoca una rotación en el plano de polarización de la luz. La interferencia de la luz produce una serie de colores, lo que crea imágenes espectaculares.

Figura 2. Imágenes de la vitamina C usando microscopía de polarización. a) Con la polarización lineal, se ven figuras de interferencia uniaxial (cruces de patrón maltés). b) La polarización circular no produce un patrón maltés. Las estructuras que parecen piedras marrones, son cristales muy gruesos. Imágenes capturadas con el escáner de portaobjetos dedicado a la investigación y el objetivo MPLAPON50X (A. N. de 0.95).

Figura 3. Imágenes de tejido conectivo/conjuntivo y hueso, en las que se visualizan fibras de colágeno con distintas orientaciones bajo luz polarizada. a) Tejido conectivo/conjuntivo visualizado con luz polarizada lineal. b) Tejido conectivo/conjuntivo visualizado con luz polarizada circular. c) Corte transversal de hueso, visualizado con luz polarizada lineal. d) Corte transversal de hueso, visualizado con luz polarizada circular. Las fibras de colágeno alineadas en modo transversal aparecen claras, mientras que aquellas alineadas en modo longitudinal aparecen oscuras. Las fibras con orientaciones intermedias muestran tonos variados de grises. Imágenes capturadas con el escáner de portaobjetos dedicado a la investigación y el objetivo MPLAPON50X (A. N. de 0.95).

Importancia del procesamiento de imágenes con luz polarizada para las investigaciones de los tejidos óseos y la vitamina C

Capturar imágenes espectaculares con la microscopía de polarización es tan agradable desde un punto de vista estético; pero, ¿qué importancia tienen estas imágenes? Con respecto a la vitamina C, la interacción de sus moléculas con la luz polarizada es una propiedad que se usa para el análisis químico, ya que permite determinar su concentración y pureza. Este se efectúa normalmente con un polarímetro.

En el caso de los huesos, los estudios que aplican la microscopía de polarización circular han sido empleados para representar gráficamente los patrones de orientación de las fibras de colágeno. Estos se han correlacionado con los datos de tensión ósea. Ahora se sabe que las fibras de colágeno, cuando presentan una orientación transversal predominante, son más resistentes a fuerzas de compresión, mientras que las fibras longitudinales tienen una mejor resistencia a las fuerzas de tensión. Además, las fibras de colágeno orientadas en ángulos de 45° a partir de la lamela proporcionan una mejor resistencia al cambio de dirección.

Asimismo, se ha demostrado que la orientación de las fibras de colágeno en el cartílago es importante para resistir la presión y deformación causadas por las cargas o movimiento. Las alteraciones en la organización del colágeno dentro del cartílago, aunque sean menores, se han relacionado con enfermedades patológicas como la osteoartritis (artrosis).

*Los componentes de polarización circular del escáner VS200 actualmente sólo se encuentran disponibles en la región EMEA. Póngase en contacto con su representante de ventas de Evident para obtener más detalles sobre su disponibilidad.
 

Referencias

1. Bromage, T., et al. 2023. «Circularly Polarized Light Standards for Investigations of Collagen Fiber Orientation in Bone». The Anatomical Record. 274(1): 157–168. 
2. Chin, K. Y. e I-N. Soelaiman. 2018. «Vitamin C and Bone Health: Evidence from Cell, Animal, and Human Studies». Current Drug Targets. 19(5): 439–450.
3. Aghajanian. P., et al. 2025. «The Roles and Mechanisms of Actions of Vitamin C in Bone: New Developments». Journal of Bone and Mineral Research. 30(11): 1945–1955.
4. Khebtsov, N., et al. 2016. «Chapter 1: Introduction to Light Scattering by Biological Objects.» Handbook of Optical Biomedical Diagnostics. 2nd ed., vol. 1: Light-Tissue Interaction, editado por V. V. Tuchin. 
5. Xia. Y., et al. 2016. «Capítulo 1: Introduction to Cartilage» Biophysics and Biochemistry of Cartilage por NMR y MRI. Royal Society of Chemistry. 1–43.
6. Clark. A., et al. 2002. «The Effects of Ascorbic Acid on Cartilage Metabolism in Guinea Pig Articular Cartilage Explants». Matrix Biology. 21(2): 175–184.
7. Mittelstaedt. D., et al. 2011. «Quantitative Determination of Morphological and Territorial Structures of Articular Cartilage from Both Perpendicular and Parallel Sections by Polarized Light Microscopy». Connective Tissue Research. 52(6): 512–522.

Autores

Laura Lleras Forero, Gerente de marketing de producto, Life Science Research, EMEA, Evident
Heiko Gäthje, Capacitador principal, Academia de formación, Evident