Análisis espacial 3D en cribado de medicamentos de alto rendimiento

Se analizaron imágenes 3D a alta velocidad de los esferoides cancerígenos con el software NoviSight™ para evaluar con precisión la eficacia del fármaco en el caso de varias muestras.

Introducción

La evaluación del rendimiento del fármaco usando esferoides cancerígenos tridimensionales es importante porque los esferoides reflejan el complejo microentorno de los tumores. Esto permite a los investigadores evaluar la eficacia del fármaco bajo parámetros que se asemejan más al entorno natural del tumor. Para un análisis de fármacos de alto rendimiento usando esferoides, los investigadores deben usar un protocolo sencillo, un procesamiento de imágenes semiautomático de alta velocidad y un análisis en 3D multipocillo. 
En este estudio, se ejecutó un ensayo de viabilidad celular homogéneo usando una placa de 384 pocillos sin cambio de líquido; se capturaron imágenes a alta velocidad usando el escáner resonante del microscopio confocal FV3000RS y se analizaron imágenes con el software 3D NoviSight. Los esferoides fueron analizados tridimensionalmente para evaluar la eficacia del fármaco en varias muestras con mayor precisión.
 

Flujo de trabajo de aplicación

Beneficios

• Usar un protocolo sencillo sin cambio de líquido
• Capturar automáticamente las imágenes usando un escáner resonante de alta velocidad
• Analizar con precisión varias muestras con un análisis espacial en 3D

Métodos

Preparación de las células

Las células de cáncer cervical de HeLa se repartieron en una placa Corning® de 384 pocillos con base redonda (100 células por pocillo) y se dejaron cultivar durante 24 horas en Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco con suero bovino fetal al 10 % (FBS). Se centrifugó la placa suavemente para eliminar las burbujas de aire.

Preparación de la muestra

Se añadieron los fármacos cisplatino y estaurosporina (STS) a las muestras con concentraciones diversas y se incubaron durante 24 horas. Gracias a la diferencia en la permeabilidad de la membrana, se determinó la viabilidad celular mediante el recuento del total de células con respecto a las células muertas usando el kit de procesamiento de imágenes de viabilidad celular ReadyProbes™ de Thermo Fisher Scientific® (total de células: azul/ células muertas: verde). A continuación, las muestras se tiñeron y se incubaron durante cinco horas. Este método de preparación sencillo no requiere cambio de líquidos, fijación ni lavado del cultivo celular hasta el procesamiento de imágenes.

Procesamiento de imágenes y análisis

Se obtuvieron imágenes fluorescentes de esferoides con el microscopio de escaneo láser confocal FV3000RS y una lente del objetivo semiapocromático LUCPFLN20X. Después de definir el área de imagen, el escáner resonante del microscopio capturó las imágenes automáticamente. El software NoviSight™ permite importar los datos de varias imágenes junto con información sobre la placa, como la posición del pocillo y la ubicación de la muestra. Después de importar dicha información, el software reconstruye las imágenes en 3D. El software NoviSight reconoce objetos, como los núcleos, y después analiza las diversas señales en ellos.
 

Fig. 1: Método para analizar fármacos sin cambio de líquidos con un alto rendimiento
 

Resultados

Procesamiento de imágenes 3D a alta velocidad de varias muestras.

Transcurrió  un minuto para observar una imagen de pila Z de un único pocillo (2,33 μm de espesor, 122 segmentos, 2 canales). El tratamiento de cisplatino y STS aumentó el número de células muertas de forma supeditada a la dosis (Fig. 2^*). 

Fig. 2: Procesamiento de imágenes a alta velocidad de la respuesta del fármaco con esferoides^*
 

Análisis 3D de alto rendimiento dedicada a la sensibilidad de los fármacos en los esferoides

El total de señales celulares (azul) permitió reconocer el núcleo (Fig. 3A^*). A continuación, se clasificaron todas las células en células vivas o células muertas basándose en la presencia o ausencia de señales verdes (señales positivas = células muertas, señales negativas = células vivas). Las señales positivas y negativas se clasificaron confirmando la imagen seleccionada en el gráfico (Fig. 3B^*). Después de la clasificación, es posible confirmar fácilmente las intensidades totales de las señales muertas en los esferoides usando un mapa térmico en el software (Fig. 4A). El porcentaje de células vivas y células totales se calculó y representó a modo de gráfico (Fig. 4B). Los resultados indicaron que los dos fármacos eran muy sensibles a las células de HeLa.
 

(A)

(B)

Fig. 3: El software NoviSight™ puede reconocer y clasificar los objetos basándose en las señales^*
 

Fig. 4: Visualización del mapa térmico y curva de respuesta a la dosis

Análisis especial de alto rendimiento de la sensibilidad al fármaco

Las imágenes en este estudio fueron capturadas en tres dimensiones para un análisis espacial avanzado. La utilización del software NoviSight™ permite definir el área objetivo para el análisis. Se configuró el software para analizar el centro y la periferia de cada esferoide (Fig. 5A). A continuación, se ejecutó un análisis poblacional dentro de estas áreas. Este método permite un análisis espacial de la eficacia del fármaco para una gran cantidad de esferoides en una placa multipocillo. Después, el software calculó la proporción de cada célula muerta con respecto al número de células en la zona central y la zona periférica (Fig. 5B). 
En este caso, el número de células muertas en la zona central y en la zona periférica aumentó de forma supeditada a la dosis. En comparación con el cisplatino, la estaurosporina es efectiva en la zona central del esferoide, incluso a bajas concentraciones.

Fig 5: Software NoviSight capaz de desarrollar un análisis espacial avanzado de las regiones del esferoide
 

Conclusión

La utilización de un protocolo sencillo, el procesamiento de imágenes confocales a alta velocidad y el software NoviSight permitió adquirir imágenes 3D con un alto rendimiento para clasificar la viabilidad celular en los esferoides y analizar la respuesta del fármaco. Esta técnica de análisis espacial permite realizar una evaluación del fármaco más avanzada para varias muestras.

Autor

Hiroya Ishihara, Biological Evaluation Technology 2, Research and Development

*Si bien estas líneas celulares forman parte de las más importantes para la investigación médica, es imperativo reconocer la contribución de Henrietta Lacks a la ciencia que se produjo sin su consentimiento. Esta injusticia, a pesar de haber dado lugar a descubrimientos clave en inmunología, enfermedades infecciosas y cáncer, también ha generado importantes debates sobre la privacidad, la ética y el consentimiento en la medicina.
Para obtener más información sobre la vida de Henrietta Lacks y su contribución a la medicina moderna, haga clic aquí.
http://henriettalacksfoundation.org/