¿Qué edad tiene el pez?: El escáner SLIDEVIEW™ VS200 se usa para superar los desafíos al estudiar los otolitos de peces.

Descripción

Los peces del género Clupea, también conocidos como arenques, han desempeñado un papel fundamental en la historia de la pesca marítima del Atlántico norte. Su estudio, a principios del siglo XX, ha sido fundamental para la evolución de la ciencia pesquera (Figura 1). Estos peces azules disponen de una larga historia como alimento sustancial.

El arenque a menudo se desplaza en grandes cardúmenes alrededor de los bancos de pesca y cerca de la costa. Se encuentra particularmente en las aguas templadas y poco profundas de los océanos Pacífico Norte y Atlántico Norte, incluido el Mar Báltico, así como en la costa oeste de América del Sur. Se reconocen tres especies de Clupea y proporcionan alrededor del 90% de todos los arenques capturados en las pesquerías.

_{Figura 1. Arenque}

Los estudios de edad y crecimiento de peces son importantes para comprender el momento y la magnitud del desove (o reproducción), el reclutamiento, el uso del hábitat, la duración de las larvas y los juveniles, como también la estructura de la población por grupo de edad. Dicho conocimiento es, a su vez, importante para establecer políticas de gestión de la pesca. Determinar la edad de un pez es posible al contar los anillos de otolitos.

_{Figura 2. Otolito de arenque.}

Los otolitos de los peces acumulan capas de carbonato de calcio y matriz gelatinosa a lo largo de la vida de estos seres. El grado de acumulación varía en función del crecimiento de los peces, normalmente es menor en el invierno y mayor en el verano, lo que da como resultado la aparición de anillos que se asemejan a los anillos de los árboles. Al contar los anillos, es posible determinar la edad de los peces en años. Además, en la mayoría de las especies, la acumulación de carbonato de calcio y matriz gelatinosa se alterna en un ciclo diario, lo que permite determinar la edad de un pez en días. Esta información debe obtenerse por medio de un microscopio y proporciona datos importantes para los estudios del ciclo vital temprano.

Experimento

Los investigadores extrajeron otolitos, los incrustaron en resina acrílica y los molieron hasta un grosor de aproximadamente 50 μm.

Tradicionalmente, para este tipo de estudio, se hubiera usado un microscopio vertical manual equipado con capacidades de luz polarizada a fin de observar el otolito y contar los anillos diarios.

Pero, la visibilidad de las capas individuales (anillos) cambia según los diferentes focos y hace que este método ocupe mucho tiempo, ya que el observador debe volver a enfocar constantemente el otolito.

En este experimento, se usó el escáner de portaobjetos SLIDEVIEW VS200 de Olympus que permitió automatizar la captura de imágenes de otolitos, lo que ahorró una cantidad importante de tiempo (Figura 3). Este sistema puede configurarse para adquirir un apilamiento en Z hasta con 31 planos a partir de diferentes magnificaciones con luz polarizada o campo claro. En la transmisión del campo claro, el diafragma de apertura motorizado puede ser ajustado para mejorar el contraste mediante el cierre de apertura frente a la apertura numérica del objetivo. (Figura 4A)

_{Figura 3. Escáner de portaobjetos dedicado a la investigación SLIDEVIEW VS200 de Olympus}

Resultados

El otolito juvenil presenta un diámetro de aproximadamente 75 μm. El otolito adulto presenta un diámetro de aproximadamente 1180 μm. La imagen 4b fue capturada por medio de la microscopía de luz polarizada, cuya configuración favorece la observación de muestras visibles que presentan ante todo un carácter ópticamente anisotrópico. El escáner debe contar con un polarizador, ubicado en la trayectoria de luz antes de la muestra, y un analizador (segundo polarizador) situado en la trayectoria óptica entre la apertura posterior del objetivo y el puerto de la cámara. El contraste de la imagen se genera a partir de la interacción de la luz polarizada en un plano con una muestra birrefringente (o doblemente refractaria); esto con el fin de producir dos componentes de onda individuales que están polarizados en planos mutuamente perpendiculares.

Al concentrarse en el centro de un otolito, los anillos son mucho más densos que en la parte exterior. Este fenómeno es claramente visible en las figuras 5A y 5B. Las imágenes también demuestran la importancia de adquirir imágenes en múltiples planos de Z (apilamiento en Z), ya que la visibilidad de los anillos cambia a través de diferentes niveles.

El sistema VS200 automatiza la adquisición de imágenes de otolitos, y libera a los usuarios de la tediosa tarea de enfoque y adquisición manual. Puesto que las imágenes están digitalizadas, es posible crear un completo programa analítico y automatizado de imágenes digitales para contar las capas de otolitos y calcular la edad.

Figura 5A. Recorte a partir del centro del apilamiento en Z del otolito juvenil. Los planos Z individuales se muestran según su posición Z en μm (comenzando desde la parte superior izquierda hacia la parte inferior derecha). La distancia entre cada plano Z es de 1,17 μm. El apilamiento en Z abarca una distancia de 20 μm, y la distancia entre las capas de otolitos en la parte central es de solo unos 600 nm.

Figura 5B. Recorte a partir del centro del apilamiento en Z del otolito adulto. Los planos Z individuales se muestran según su posición Z en μm. La distancia entre cada plano Z es de 1,17 μm. El apilamiento en Z cubre una distancia de 34 μm, y la distancia entre las capas de otolitos en la parte central es de aproximadamente 740 nm.

Conclusión

El escáner de portaobjetos dedicado a la investigación SLIDEVIEW VS200 ofrece una manera fácil y conveniente de adquirir imágenes de otolitos de peces incrustados en resina. En los peces juveniles, la distancia de la capa de otolitos es de tan sólo 600 nm aproximadamente, lo que requiere un sistema de procesamiento de imágenes capaz de ofrecer una gran magnificación y resolución. El sistema VS200, con el objetivo UPlanXApo de 40x dotado de una A. N. de 0,95, ofrece la ampliación y la resolución necesarias para capturar estas imágenes.

Las muestras de otolitos adultos también son bastante gruesas (hasta 34 μm) y poco transparentes, ya que están hechas de carbonato de calcio. El sistema VS200 proporciona funciones avanzadas que pueden superar estos desafíos y obtener imágenes de alta calidad. Para muestras gruesas, el sistema puede escanear la muestra en varios planos Z con luz polarizada. Para mejorar el contraste en las muestras de otolitos, el diafragma de apertura del sistema puede cerrarse con la intención de hacer los anillos de edad más visibles a fin de facilitar su recuento.

Reconocimientos

Esta nota de aplicación se preparó gracias a la colaboración del Dr. Bastian Huwer, Instituto Nacional de Recursos Acuáticos, Sección de Recursos Vivos Marinos, Lyngby, Dinamarca