Procesamiento de imágenes en intervalo de tiempo prolongado de la motilidad y proliferación celular con el microscopio FLUOVIEW FV3000 y la solución de compensación de deriva en Z TruFocus

Los ensayos de procesamiento de imágenes basados en cultivos celulares son pilares fundamentales para investigar una variedad de fenómenos biológicos. Gracias a esta técnica, los investigadores pueden observar la proliferación y la dinámica celular a lo largo del tiempo. Sin embargo, puesto que las poblaciones de células pueden exhibir perfiles de expresión proteica y patrones de motilidad localmente diversos, los ensayos de procesamiento imágenes deben planearse cuidadosamente para evitar sesgos o resultados sesgados creados por un muestreo insuficiente. Por lo tanto, los experimentos de procesamiento de imágenes basados en cultivos celulares deben configurarse de modo a adaptarse a múltiples campos visuales alrededor del pocillo de la microplaca o el dispositivo de cultivo. A través de esta nota de aplicación, se expone cómo el microscopio FV3000 puede facilitar la captura de imágenes en intervalos de tiempo, a partir de múltiples áreas, basado en parámetros de adquisición complejos para conjuntos de datos completos y sólidos de un solo experimento.

Captura de múltiples campos visuales en un solo experimento

Para este experimento, se usó el módulo de intervalo de tiempo de múltiples áreas (Multi-Area Time-Lapse, MATL) del microscopio confocal FV3000 a fin de monitorear continuamente la motilidad y la proliferación de las poblaciones de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) que expresan la proteína fluorescente verde citosólica (GFP) durante un intervalo de aproximadamente 12,5 horas. Mientras se planificaba el experimento, fue importante monitorear múltiples regiones con varios parámetros de magnificación y apilamiento en Z para trazar la dinámica celular individual, como también la dinámica de la población en su conjunto. Visto que el módulo MATL permite registrar parámetros independientes XYZT de cada posición o área mosaico, fue fácil programar varias condiciones de imagen para múltiples regiones en función de diferentes parámetros de magnificación y apilamiento en Z a lo largo del tiempo.

_{Figura 1. Esquema de experimento con intervalo de tiempo de múltiples áreas. En cada pocillo de una placa multipocillo, múltiples posiciones de áreas individuales y en mosaico fueron programadas en función de varios parámetros independientes de magnificación y apilamiento en Z. Las imágenes de estas posiciones registradas fueron capturadas en un ciclo temporal de 12 horas y 25 minutos.}

Uso del enfoque automático específico por ubicación para monitorizar la motilidad y proliferación celular de las HUVEC

Uno de los mayores desafíos en el procesamiento de imágenes de múltiples áreas a lo largo del tiempo es la tendencia que presenta el enfoque al variar de forma gradual por pequeñas fluctuaciones de temperatura en el ambiente de la sala del microscopio. Asimismo, la distancia que existe entre la superficie del cubreobjetos y el tejido de muestra puede variar en su área superficial, lo que dificulta aún más la obtención de imágenes claras a partir de múltiples campos de visión. El sistema de compensación de deriva en Z TruFocus enfrenta estos problemas mediante el uso de un láser de infrarrojo cercano, no fototóxico, que localiza la interfaz entre el cubreobjetos y la muestra, y determina la posición focal correspondiente. Al combinar el sistema TruFocus con la función MATL, es sencillo almacenar múltiples posiciones independientes XYZT gracias al enfoque automático específico por ubicación.

En este experimento, se usaron múltiples regiones en función de diferentes parámetros de magnificación y apilamiento en Z a lo largo del tiempo para monitorizar los cambios en la motilidad y la proliferación de las HUVEC, tanto a nivel celular individual como a nivel poblacional completo. Tal y como se muestra en los aspectos más destacados del video de la Figura 2, la combinación del MATL con el sistema TruFocus permitió un procesamiento de imágenes reproducible de múltiples pocillos, al mismo tiempo que se mantenía un enfoque nítido durante el transcurso del experimento de 12 horas.

_{Figura 2. Procesamiento de imágenes en intervalo de tiempo de múltiples áreas XYZT de HUVEC que expresan GFP citosólico. Cuatro imágenes, procedentes de diferentes posiciones, son mostradas en función de distintos parámetros de adquisición. El sistema TruFocus se activó para mantener la muestra enfocada en los diversos campos de visión durante el período experimental de 13 horas.}

Condiciones de procesamiento de imágenes

En los dos paneles superiores:
Objetivo UPLXAPO20X
Microscopio: Microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW FV3000
Láser: 488 nm (GFP, verde)
Escáner: Escaneo resonante
Serie Z: 16 pasos
Número total de áreas escaneadas: 14

En los dos paneles inferiores:
Objetivo UPLXAPO10X
Microscopio: Microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW FV3000
Láser: 488 nm (GFP, verde)
Escáner: Escaneo resonante
Serie Z: 15 pasos
Número total de áreas escaneadas: 48

Tiempo experimental total: 13 horas y 11 minutos.

¿Cómo el microscopio confocal FV3000 ha respaldo el experimento?

Mantener el enfoque durante los intervalos de tiempo en múltiples áreas con el sistema de compensación de deriva en Z TruFocus de Olympus

El sistema de compensación de deriva en Z TruFocus (ZDC) es un módulo totalmente motorizado que enfrenta la deriva focal para mantener la muestra en un enfoque nítido durante experimentos con intervalos de tiempo de largo plazo. El sistema TruFocus potencia las capacidades de la aplicación al soportar una gran cantidad de objetivos y tipos de recipientes, como placas con fondo de vidrio y plástico. Esto permite a los usuarios generar datos de intervalos claros, enfocados y continuos bajo múltiples condiciones de procesamiento de imágenes, sin preocuparse por la deriva en Z.

Módulo de software MATL para parámetros independientes de XYZT El módulo de software de intervalo de tiempo de múltiples áreas (multi-area time-lapse, MATL) permite controlar la platina XY motorizada del microscopio FV3000, lo que proporciona parámetros independientes XYZT para cada ubicación registrada o área en mosaico. El módulo MATL brinda datos de intervalo de tiempo precisos y sólidos al cumplir una integración completa de hardware y la sincronización precisa proporcionada por el microscopio invertido FV3000. Esto hace que el sistema sea idóneo para obtener imágenes a partir de los numerosos materiales de cultivo con fondo de vidrio, disponibles en el mercado, o incluso de dispositivos y microplacas hechos a medida.

Comentario del Dr. James Hoying Trabajamos con una variedad de modelos de tejidos vascularizados 3D, que se preparan en los varios pocillos de las placas multipocillo. Las características del sistema TruFocus y el módulo de software MATL del microscopio FV3000 han sido de valor incalculable, ya que a menudo se requieren mediciones de la vascularización y la morfología de los vasos en docenas de tejidos, al mismo tiempo que se usan imágenes confocales de alta resolución de las vasculaturas 3D.

Reconocimientos

Esta nota de aplicación ha sido redactada con la ayuda de los siguientes investigadores:

Dr. James Hoying, director científico, Advanced Solutions Life Sciences