Procesamiento de imágenes volumétricas dinámicas con el microscopio confocal FV3000RS: Reconstrucción 3D de la dinámica de la actina en una espora de Colletotrichum graminicola

El Colletotrichum graminicola es un hongo patógeno difundido y un importante agente causante de enfermedades en los cultivos de cereales, como el trigo y el maíz. En el maíz, las infecciones fúngicas de C. graminicola causan el tizón de las hojas por antracnosis (cancro), causando graves daños a los cultivos y grandes pérdidas económicas para los agricultores. Por ende, comprender la dinámica citoesquelética en la germinación de esporas de C. graminicola podría contribuir a la prevención de dichas enfermedades.

Organización de la etapa de pregerminación de los cables filamentosos de actina

Para este experimento, se usó el microscopio FLUOVIEW FV3000RS a fin de estudiar la dinámica de la actina en una espora de C. graminicola previa a la germinación. Se pudieron observar cables filamentosos de actina dentro de una espora en forma de media luna que aún no ha germinado. Los cables se han organizado de forma extendida longitudinalmente a través de la espora en el plano de contacto con la superficie. Es posible observar cómo los cables de actina se retraen desde el centro hacia cualquier extremo de la espora.

Figura 1: Reconstrucción XYZT de la dinámica de la actina en una espora de C. graminicola previa a la germinación.

Condiciones de imagen
Objetivo: Objetivo TIRF de 100X con aceite y A. N. de 1.49 (UAPON100XOTIRF)
Microscopio: Microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW FV3000
Láseres: 488 nm (GFP, verde), 561 nm (DIC, gris)
Escáner: Escáner resonante
Fotogramas XY: 0,272 s./fotograma
Serie Z: 22 etapas (6 s./sección)
Serie T: 30 apilamientos en Z adquiridos en tres minutos

Observación de dos eventos citoesqueléticos distintos durante la germinación

Tras la organización de la actina en cables, el proceso de germinación de una espora de C. graminicola se ve marcado por dos eventos citoesqueléticos sucesivos, ambos acompañados por la formación de  parches y cables. En el primer evento, el citoesqueleto se organiza nuevamente para formar un septum (septo) que delimita la espora fúngica en dos células distintas (representada por la barrera medial a lo ancho de la espora). Después del evento de tabicación, los cables de actina se forman en el sitio de germinación y se extienden en tubo germinativo hacia el ápice. Las Figuras 2 y 3 muestran los dos eventos.

Figura 2: Reconstrucción XYZT de la formación de paredes transversales durante un evento de tabicación en una espora en germinación de C. graminicola, seguido de la formación de un tubo germinativo.

Condiciones de imagen
Objetivo: Objetivo TIRF de 100X con aceite y A. N. de 1.49 (UAPON100XOTIRF)
Microscopio: Microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW FV3000
Láseres: 488 nm (GFP, verde), 561 nm (DIC, gris)
Escáner: Escáner resonante
Fotogramas XY: 0,470 s./fotograma
Serie Z: 31 etapas (5,35 s./apilamiento)
Serie T: 34 apilamientos en Z adquiridos en intervalos de 1 minuto en 33 minutos

Figura 3: Reconstrucción tridimensional del citoesqueleto de actina en una espora de C. graminicola en proceso de germinación; en ella, se puede observar claramente el tubo germinativo.

Condiciones de imagen
Objetivo: Objetivo TIRF de 100X con aceite y A. N. de 1.49 (UAPON100XOTIRF)
Microscopio: Microscopio confocal de escaneo láser FLUOVIEW FV3000
Láseres: 488 nm (GFP, verde), 561 nm (DIC, gris)
Escáner: Escáner galvanométrico 
Secciones Z: 17 etapas

¿Cómo el microscopio confocal FV3000 ha respaldo el experimento?

Mantenimiento de un enfoque en intervalos de tiempo de 4D con el compensador de deriva en Z TruFocus de Olympus

El avanzado sistema de compensación de deriva en Z TruFocus (ZDC) facilita la adquisición de múltiples apilamientos en Z consecutivos sin presencia de derivas en la dimensión Z. Esto permite a los usuarios crear intervalos de tiempo claros, enfocados y continuos en tres dimensiones, lo que permite a los investigadores investigar la dinámica de las proteínas en toda la muestra sin preocuparse por la deriva en Z.

Adquisición rápida en 4D con el escáner resonante

El microscopio FV3000RS cuenta con un escáner resonante de alto rendimiento que favorece intervalos de tiempo rápidos al adquirir la dinámica de las células vivas. El escáner resonante del microscopio FV3000RS también mantiene un campo de visión completo de 1X con N.º de campo (FN) 18 y velocidades de refresco de 30 fotogramas por segundo a 512 × 512 píxeles. Al usar el escáner resonante, los investigadores pueden adquirir apilamientos en Z de varios niveles en sólo segundos. Esto permite lograr apilamientos en Z de alta resolución para fenómenos que se desarrollan rápidamente en células vivas.

Asimismo, los detectores GaAsP TruSpectral proporcionan alta sensibilidad para obtener las imágenes de células vivas.

Integrada en todos los microscopios confocales FV3000, la tecnología de detección TruSpectral permite un mayor rendimiento de luz en comparación con las unidades de detección espectral convencionales. El holograma de fase y volumen difracta la luz con una eficiencia de transmisión hasta tres veces mayor que la de las redes de reflexión. Por otra parte, cuando el detector espectral de alta sensibilidad (HSD) del microscopio FV3000, es combinado con los PMT GaAsP de alta eficiencia, requiere una potencia láser mínima a fin de obtener imágenes con una óptima relación señal-ruido, lo cual facilita un procesamiento de imágenes de células vivas potente pero al mismo tiempo equilibrado.

Comentario de Joseph Vasselli y Dr. Brian Shaw

Nuestra investigación tiene como objetivo comprender el papel del citoesqueleto y las proteínas endocíticas en el crecimiento y desarrollo de los hongos filamentosos. La monitorización de la localización espacio-temporal de estas proteínas durante los cambios en la polaridad del crecimiento es crucial para nuestros experimentos. La excelente compensación de deriva en Z del microscopio FV3000, los detectores de alta sensibilidad y el escáner resonante rápido nos permiten llevar a cabo adquisiciones XYZT de alta resolución para estudiar de manera efectiva la dinámica de estas proteínas en células vivas.

Agradecimientos

Esta nota de aplicación ha sido elaborada con la ayuda de los siguientes investigadores.