Imágenes de alta resolución de interacciones de células óseas usando el microscopio confocal FLUOVIEW FV3000 y un objetivo de inmersión en aceite X Line de 40 X
La estructura ósea se remodela constantemente mediante una compensación de reabsorción ósea osteoclástica y formación ósea osteoblástica. Sin embargo, ciertos factores de salud pueden causar un desequilibrio, provocando que el hueso se vuelva quebradizo dentro del marco de las enfermedades óseas, como la osteoporosis. Para comprender el mecanismo de remodelación ósea, es importante observar las interacciones entre los osteoclastos y los osteoblastos.
En este estudio, se dispuso de un seccionamiento transversal de la tibia de un ratón (Figura 1), y se observó de cerca los osteoclastos y osteoblastos en la zona límite entre la médula ósea y el hueso cortical. Por lo general, esta aplicación requiere el uso de un objetivo de baja magnificación para capturar un amplio campo de visión con el fin de identificar una región de interés, seguido por el uso de un objetivo de inmersión en aceite de alta magnificación para observar los detalles con mayor resolución. Sin embargo, esta metodología puede ser compleja debido a la pérdida de la región de interés que se produce cuando se intercambian los objetivos.
Por el contrario, aquí se identificó la región de interés en un amplio campo de visión y se observó finas estructuras en alta resolución usando sólo un objetivo de inmersión en aceite de 40X sin cambiar de objetivo.
Figura 1: Seccionamiento transversal de la tibia
Procesamiento de imágenes de alta resolución de interacciones de células óseas con un objetivo de inmersión en aceite X Line de 40X (UPLXAPO40XO)
Se observó la zona límite entre la médula ósea y el hueso cortical en un seccionamiento transversal de la tibia de un ratón, así como el área de contacto (vea * en la Figura 2a) de los osteoblastos (verde) con las células endoteliales vasculares (amarillo), y el área de interacción (vea # en la Figura 2a) de los osteoblastos con los osteoclastos (rojo). El amplio campo de visión del objetivo de inmersión en aceite de 40X permitió adquirir una imagen que muestra la ubicación de la imagen de alta magnificación dentro de la imagen panorámica completa (inserción de la Figura 2a).
Mediante el uso del zoom de exploración, se pudo observar de cerca del área de interacción de los osteoblastos con los osteoclastos (Figura 2b). La calidad de la imagen obtenida con el objetivo UPLXAPO40XO de la X Line fue casi la misma que aquella obtenida con un objetivo convencional UPLSAPO60XO (Figura 2c).
Figura 2: Imágenes fluorescentes de un seccionamiento transversal de la tibia de un ratón
Imagen obtenida usando un zoom de exploración 1x con un objetivo UPLXAPO40XO
Imagen obtenida con un zoom de exploración de 3,45x con un objetivo UPLXAPO40XO
Imagen obtenida con un zoom de exploración de 2.03x con un objetivo UPLSAPO60XO
Condiciones de procesamiento de imágenes
Microscopio: Sistema FV3000
Objetivo: UPLXAPO40XO (UPLSAPO60XO usado como referencia)
Láseres: 488 nm (Alexa Fluor 488, verde), 561 nm (Alexa Fluor 568, rojo), 640 nm (Alexa Fluor 647, amarillo)
¿Cómo el microscopio confocal FV3000 favoreció a nuestro experimento?
Imágenes de alto rendimiento con objetivos X Line
La alta apertura numérica (A. N.) de los objetivos X Line permite recoger más luz para obtener imágenes más brillantes y de mayor resolución. |  |
Adquisición de imágenes con óptima relación señal-ruido (SNR) bajo condiciones de luz de baja excitación
| Gracias a su tecnología de detección espectral patentada, los detectores TruSpectral del microscopio confocal FV3000 combinan alta sensibilidad con flexibilidad espectral para detectar incluso los fluorocromos más débiles. Los detectores TruSpectral albergan hasta cuatro canales de tubos fotomultiplicadores (PMT) GaAsP con una eficiencia cuántica de hasta el 45 %, permitiendo así que los usuarios vean muestras bastante tenues que es imposible con los equipos convencionales. El enfriamiento a efecto Peltier reduce el ruido de fondo en un 20 % para proporcionar imágenes con una óptima relación señal-ruido bajo condiciones de luz de muy baja excitación. |  |
Comentario de la Dra. Yukiko Kuroda
| Fue difícil encontrar las áreas de interacción durante el procesamiento de imágenes de alta resolución provenientes de las interacciones de los osteoclastas y los osteoblastos cuando se alternaba un objetivo seco de baja magnificación, a fin de obtener un campo de visión amplio, por un objetivo UPLSAPO60XO para generar imágenes de alta resolución. Otro desafío fue la adición de aceite durante el proceso de captura de las imágenes. Por otro lado, cuando se usó el objetivo UPLSAPO60XO para todo el proceso de captura de imágenes, nos llevó mucho tiempo encontrar la región de interés debido al estrecho campo de visión. Este estudio demuestra que se pudo encontrar con éxito las áreas de interacción y adquirir imágenes de alta resolución equivalentes a aquellas adquiridas con el objetivo UPLSAPO60XO mediante el uso de un sólo objetivo de inmersión en aceite de 40X (UPLXAPO40XO), dotado de una alta apertura numérica (A. N.) equivalente a la del objetivo UPLSAPO60XO. Fruto de este experimento, se observó de forma eficiente las interacciones entre los osteoclastos y los osteoblastos usando sólo el objetivo UPLXAPO40XO. |
Reconocimientos
Esta nota de aplicación ha sido preparada con la ayuda de la Dra. Yukiko Kuroda. Profesora de la Universidad de Keio y responsable de las imágenes otorgadas para ilustrar este informe.
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