Determinación de la proliferación y citotoxicidad celular con mayor precisión y facilidad a través del sistema de monitorización de incubación CM20

Introducción

El ensayo de proliferación/citotoxicidad celular es una de las pruebas más usadas en la investigación de cultivos celulares. Es un paso preliminar y esencial para examinar las concentraciones de medicamentos que se utilizarán en los tratamientos, y sirve como prueba muy importante para determinar la eficacia y seguridad de los medicamentos en diversos campos de investigación, como la oncología y la muerte celular.

Tradicionalmente, el ensayo WST-8 o ATP (que usa la actividad metabólica como índice) y el ensayo BrdU o de timidina (que usa el nivel de síntesis del ADN como índice) han sido empleados a fin de evaluar de forma cuantitativa las características de crecimiento celular. Si bien estos ensayos son una ventaja debido a su simplicidad y rendimiento, todos son métodos de evaluación indirectos; por consiguiente, puede que los resultados no correspondan con la cantidad real de células. En muchos casos, se trata de evaluaciones terminales, que a veces han resultado defectuosas al absorber los cambios temporales, lo que conlleva a pasar por alto descubrimientos importantes.

Dadas todas estas limitaciones, se considera que el desarrollo de un método para ejecutar evaluaciones directas y temporales de la proliferación/citotoxicidad celular es importante en los campos de la investigación donde se usan cultivos celulares.

Esquema experimental

A fin de verificar la capacidad del sistema de monitorización de incubación OLYMPUS Provi CM20 en la evaluación de la proliferación/citotoxicidad celular, se llevaron a cabo los siguientes dos ensayos que permitirían comparar el sistema CM20 con un ensayo convencional (WST-8):

• Ensayo de muerte celular con medicamento anticanceroso (5-FU) en células A549 provenientes de un adenocarcinoma de pulmón humano
• Ensayo de muerte celular con neurotoxina (6-OHDA) en células SH-SY5Y provenientes de un neuroblastoma humano

Procedimientos experimentales

Ensayo de muerte de células cancerosas con medicamento anticanceroso (5-FU)

Se sembraron las células A549, provenientes de un adenocarcinoma de pulmón humano, en una placa multipocillos. Las células fueron tratadas con 5-FU (400 μM) durante 72 horas a partir de las 24 horas posteriores a la siembra, por medio del procesamiento de imágenes y recuento de la cantidad de células a cada hora con el sistema CM20. La concentración del medicamento 5-FU, para el tratamiento, se estableció en función de mantener la proliferación y muerte celular compensadas frente a un grupo no tratado con 5-FU, determinado como control. Se usaron métodos convencionales para medir la viabilidad celular a cada 0, 24, 48 y 72 horas tras iniciar el tratamiento mediante el ensayo WST-8.

Ensayo de muerte celular con neurotoxina (6-OHDA)

Se sembraron las células SH-SY5Y, provenientes de un neuroblastoma humano, en una placa multipocillos. Las células fueron tratadas con 6-OHDA (60 μM) durante 24 horas a partir del momento en que se sembraron, por medio del procesamiento y recuento de la cantidad de células a cada hora con el sistema CM20. La concentración del medicamento 6-OHDA, para el tratamiento, se estableció para inducir la muerte celular rápida, junto con un grupo no tratado por medio de 6-OHDA, establecido como control. El método convencional midió la viabilidad celular a las 0, 6, 12 y 24 horas tras el inicio del tratamiento mediante el ensayo WST-8.

Resultados

Ensayo de muerte de células cancerosas con medicamento anticanceroso (5-FU) y células A549

Figura 1. Imágenes de células A549 tras tratamientos con 5-FU.
Línea superior: grupo no tratado con 5-FU. Línea inferior: grupo tratado con 400 μM de 5-FU.

En el grupo no tratado con 5-FU, el número de células aumentó con la duración del cultivo, y se observó que las células eran 100 % confluentes cerca de las 72 horas de tratamiento. En el grupo tratado con 5-FU, el número de células muertas aumentó con la duración del tratamiento, sin que se produjeran cambios significativos en la densidad celular tras el tratamiento de 24 horas.

Figura 2. Determinación cuantitativa de la viabilidad de las células A549.
Izquierda: Cantidad de células determinada por el CM20. Derecha: Cantidad de células determinada por el método de ensayo convencional (WST-8).

El análisis con el sistema CM20 mostró que la cantidad de células aumentó, en una curva sigmoidea, en el grupo no tratado con 5-FU, mientras que la cantidad de células no cambió significativamente después del tratamiento de 24 horas en el grupo tratado con 5-FU. Esto indica que la proliferación y la muerte celular estaban compensadas. Estos resultados son coherentes con la observación de las células. También coinciden con los resultados obtenidos por el método convencional (ensayo WST-8).

Ensayo de muerte de células cancerosas con neurotoxina (6-OHDA) y células SH-SY5Y

Figura 3. Imágenes de células SH-SY5Y tras los tratamientos con 6-OHDA.
Línea superior: grupo sin tratar con 6-OHDA. Línea inferior: grupo tratado con 60 μM de 6-OHDA.

En el grupo no tratado con 6-OHDA, se observó un ligero aumento en la cantidad de células tras las 24 horas. En el grupo tratado con 6-OHDA, se observó una disminución en la cantidad de células tras el tratamiento de 6 horas, y en el tratamiento de 12 horas, se observó que la mayoría de las células estaban muertas.

Figura 4. Determinación cuantitativa de la viabilidad de células SH-SY5Y.
Izquierda: Cantidad de células determinada por el sistema CM20. Derecha: Cantidad de células determinada por el método de ensayo convencional (WST-8).

El análisis con el sistema CM20 mostró que la cantidad de células aumentó ligeramente, tras 24 horas, en el grupo sin tratamiento con 6-OHDA, mientras que en el grupo tratado con 6-OHDA, la cantidad de células comenzó a disminuir tras 3 horas y continuó disminuyendo desde entonces. La cantidad de células no mostró cambios significativos tras el tratamiento de 12 horas, lo que indica que casi todas las células murieron dentro de las 12 horas posteriores al tratamiento. Estos resultados son coherentes con la observación de las células. También coinciden con los resultados obtenidos por el método convencional (ensayo WST-8).

Discusión sobre los resultados obtenidos con el sistema CM20 en comparación con el ensayo convencional

El análisis mediante el sistema de monitorización CM20 sobre la acción del medicamento anticanceroso en células cancerosas y la neurotoxicidad de otro medicamento en las células del sistema nervioso proporcionó casi los mismos resultados que los obtenidos con la observación de imágenes y un método convencional (ensayo WST-8).

Beneficios de las evaluaciones con el sistema de monitorización de incubación CM20

Uno de los beneficios al usar el sistema CM20 para la evaluación es el breve intervalo de muestreo que permite a los usuarios determinar los detalles entre los cambios temporales. Por ejemplo, la prueba con las células SH-SY5Y muestra que casi todas las células murieron aproximadamente 12 horas después del tratamiento con 6-OHDA. Entretanto, los ensayos terminales no proporcionan tal información.

Otro beneficio del sistema CM20 es que los datos del curso temporal pueden obtenerse a partir de una sola placa. El método convencional requiere preparar una placa para cada punto temporal de medición, lo que aumenta la cantidad de trabajo por el número de puntos temporales y limita la cantidad de placas a analizar. Además, un aumento de puntos de medición al usar un método de ensayo convencional también empeora la complejidad analítica de los datos. Por su parte, el sistema CM20 permite la observación multipunto y la generación de gráficos a partir de los resultados de forma automática.

Un beneficio adicional del sistema CM20 deriva de su función de adquisición automática de imágenes que permite a los usuarios revisar el estado de la proliferación celular y los cambios morfológicos, incluso después de que la etapa de análisis de datos haya iniciado. El sistema CM20 almacena las imágenes de las células a lo largo del análisis para que el investigador pueda recopilar y analizar más información de potencial crítico. Incluso en los casos en que el método convencional requiere una adecuada estimación de la duración de los tratamientos, mediante el análisis de varios puntos, y seguidos de nuevas pruebas, el análisis con el sistema CM20 permite a los usuarios determinar la duración adecuada de los tratamientos a futuro en una sola prueba y extraer los datos dentro de esa duración.

Comentarios del Dr. Yamaguchi

Antes que nada, me ha impresionado la precisión en el recuento de células al usar el sistema de monitorización de incubación CM20. Las células reconocidas por el sistema CM20 se mostraron por separado en un monitor, una por una. Pude confirmar que este ensayo permite evaluaciones cuantitativas altamente reproducibles cuando los parámetros iniciales se establecen correctamente.

A diferencia del método convencional de medición indirecta con respecto a la cantidad de células, el sistema CM20 no requiere ningún marcado. Puesto que el marcado puede afectar a las células, el hecho de evitar este procedimiento hace que el sistema CM20 sea un método de ensayo fiable para la evaluación de la cantidad de células. Además, el punto fuerte del sistema CM20 es que permite la adquisición casi automática de datos en muchos puntos temporales usando una sola placa, lo que reduce en gran medida la cantidad de trabajo y elimina el riesgo de pasar por alto datos importantes.

Dependiendo de los tipos y concentraciones de los medicamentos (fármacos) utilizados en los experimentos, es posible observar algunas variaciones a través de los tratamientos incluso en el supuesto caso que no se observe ninguna diferencia en el período terminal, cuando todas las células están muertas o han alcanzado la confluencia. Creo que el uso del sistema CM20 puede reducir en gran medida el tiempo y esfuerzo necesario para estimar la duración del tratamiento en estos casos, lo que podría mejorar la eficiencia y la velocidad de la investigación.

Agradecimientos

Esta nota de aplicación fue redactada con la ayuda del siguiente investigador:
Dr. Takahiro Yamaguchi, investigador principal, ACEL, Inc.