Validierung von Mehrpunktbeobachtungen mit einem Inkubationsüberwachungssystem

Einführung

Die Aufrechterhaltung und Überprüfung angemessener Zellkulturbedingungen im Rahmen der täglichen Routine erfordert viel Zeit und Mühe. Unter anderem bedeutet dies, dass die Zellen immer wieder aus dem Inkubator genommen werden müssen, um ihren Zustand zu überprüfen, indem ihre Anzahl und ihr Konfluenzgrad unter dem Mikroskop überprüft werden.

Zudem muss die Qualität der Zellen während der Vorbereitungsphase konstant gehalten werden, um die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Experimente zu verbessern. Allerdings können je nach Qualifikation der für die Zellkultivierung zuständigen Person und anderen Faktoren Unterschiede bezüglich der Qualität der Vorgänge auftreten. Da die Zellkultur der Ausgangspunkt der biowissenschaftlichen und medizinischen Forschung ist, hat die Qualität der Zellen einen erheblichen Einfluss auf die nachfolgenden Experimente. Folglich muss die Zellqualität basierend auf bestimmten Zellkulturbedingungen angemessen aufrechterhalten werden.

Unser CM30 Inkubationsüberwachungssystem vereinfacht diesen Prozess, indem es die Zellkulturbedingungen automatisch und ferngesteuert vom Inneren des Inkubators aus überwacht – 24 Stunden am Tag und 365 Tage im Jahr. Außerdem kann es den Zustand der Zellen in regelmäßigen Abständen basierend auf KI-basierten Analyseergebnissen anzeigen. Mit kontinuierlichen und standardisierten Messungen ermöglicht das CM30 System eine objektive, effiziente und reproduzierbare Quantifizierung des Zellstatus.
 

Schätzung des Status der Zelle im gesamten Behälter anhand von Mehrpunktbeobachtungen

Zur Aufrechterhaltung der Zellqualität ist es wichtig, den Zellzustand täglich überprüfen und entsprechende Anpassungen vorzunehmen. Bislang musste der gesamte Behälter mühsam und zeitaufwändig unter dem Mikroskop überprüft werden, um den Zustand der Zellen und den richtigen Zeitpunkt für das Passagieren und die Entnahme der Zellen zu ermitteln. Zu diesem Zeitpunkt müssen selbst bei entsprechender Erfahrung das Beobachtungsfeld sowie das gesamte Kulturgefäß überprüft werden, da der Zustand der ausgesäten Zellen je nach Zellart, Gefäß und Vorgehensweise ungleichmäßig sein kann.

Das CM30 System ist daher in der Lage, den gesamten Behälter einmal am Tag automatisch abzubilden und dann jeden beliebigen Beobachtungspunkt wiederholt anzuzeigen. So kann die Kamera weiterhin die gewünschte Beobachtungsposition abbilden, während sie in regelmäßigen Abständen Informationen über den kompletten Behälter erfasst.

Die Erfassung von Informationen über den gesamten Behälter zu jedem Zeitpunkt des Zellkulturprozesses kann jedoch verschiedene Risiken mit sich bringen, sowohl was die Hardware als auch die Software betrifft. Beispielsweise ist die Verwaltung der Daten aufgrund des hohen Erfassungsaufwands und des großen Datenvolumens kompliziert. Zudem steigt die Temperatur im Inkubator durch den anhaltenden Betrieb des Überwachungssystems an, sodass die Auswirkungen dieser Temperaturveränderungen auf die Zellen berücksichtigt werden müssen.

Um gleichzeitig die Zuverlässigkeit der Daten zu erreichen und diese Risiken zu vermeiden, zählt das CM30 System die Anzahl der Zellen zu mehreren Zeitpunkten (Abbildung 1), die entsprechend der Gefäßgröße zu jedem Zeitpunkt definiert sind, und schätzt dann den Status der Zellkultur im gesamten Gefäß anhand des Durchschnitts der Analyseergebnisse. Dadurch kann das CM30 System effizient quantitative Daten mit geringer Abweichung von den tatsächlichen Kulturbedingungen erfassen.

In diesem Whitepaper stellen wir die Ergebnisse der quantitativen Erfassung, des Vergleichs und der Überprüfung von Daten* mit dem CM30 System vor, um die Validität der Schätzung des Status der Zelle in einem kompletten Behälter anhand mehrerer Punkte zu bestätigen.

*Dieses Whitepaper enthält die Ergebnisse einer internen Verifizierung durch Evident.

Abbildung 1: Anzahl der Mehrpunkt-Beobachtungspunkte in verschiedenen Zellkulturbehältern.
 

Vergleichende Überprüfung von Schätzungen der Zellanzahl

Um die Ergebnisse der Analyse hinsichtlich der Zellzählungen vergleichen zu können, wurden zur Validierung folgende Zelltypen und Kulturgefäße verwendet.

Zelltyp, Kulturgefäß (Anzahl der Mehrpunkt-Beobachtungspunkte)

• A549, 12-Well-Platte (9 Punkte pro Well)
• NHEK, T75-Flasche (25 Punkte)

Insbesondere wurden dieselben Analyseparameter auf das gesamte Gefäß und auf jeden der mehreren Beobachtungspunkte angewendet, die für jedes Gefäß im CM30 System zum selben Zeitpunkt definiert wurden, und die Ergebnisse der Zellanzahl wurden verglichen. Um die Ergebnisse über den gesamten Zellproliferationsprozess hinweg zu vergleichen, wurden die Ergebnisse auch für alle drei Zelldichten validiert: niedrig, mittel und hoch.

Die Validität der Mehrpunktbeobachtung mit dem CM30 System wurde durch den Vergleich der Zellanzahl für das gesamte Gefäß, geschätzt anhand des Durchschnitts der an mehreren für jedes Gefäß definierten Punkten analysierten Zellzahlen, mit der durch Betrachtung des gesamten Gefäßes geschätzten Zellzahl als tatsächlichem Wert für die drei oben genannten Zelldichten überprüft.

Um zu überprüfen, inwieweit die Zellanzahl bei der Schätzung des gesamten Behälters anhand nur eines Beobachtungspunktes variiert, verglichen wir die Anzahl der Zellen im gesamten Behälter, geschätzt anhand der maximalen und minimalen Zellanzahl an dem einen Beobachtungspunkt, erhalten durch die oben beschriebene Gesamtbeobachtung, mit der tatsächlichen Zellanzahl (tatsächlichen Werte) für den gesamten Behälter.
 

Relevanz von Mehrpunktbeobachtungen mit einem Inkubationsüberwachungssystem

Abbildung 2 zeigt einen Vergleich der Zählungsschätzungen (tatsächliche Werte) für den gesamten Behälter und der Zählungsschätzungen auf Basis der Mehrpunktbeobachtungen in einer 12-Well-Platte und einer T75-Kulturflasche.

Abbildung 2: Fehler bei der Schätzung der Zellzahl im Vergleich zwischen der Beobachtung des gesamten Gefäßes und der Beobachtung an mehreren Punkten.

In der Regel erfolgt die Zellanzahl- und Konfluenzanalyse zur Qualitätskontrolle während des Zellpräparationsprozesses mit einer Genauigkeit von ± 10 % des tatsächlichen Wertes. Bei dieser Überprüfung lag bei der 12-Well-Platte und bei der T75-Flasche der Fehler im Vergleich zwischen dem gesamten Behälter und der auf der Mehrpunktbeobachtung basierenden Schätzung während des gesamten Wachstumsprozesses bei ± 2 %.

Daher waren wir der Meinung, dass die Schätzungen, die von der Mehrpunktbeobachtung des einzelnen Gefäßes stammen, ausreichend zuverlässige Daten lieferten, ohne dass der gesamte Behälter betrachtet werden musste. Selbst unter schwierigen Bedingungen, wie z. B. bei einer 12-Well-Platte mit einer geringen Anzahl von Beobachtungspunkten pro Gefäßbereich, lag der Fehler bei den geschätzten Werten für das gesamte Gefäß während des gesamten Wachstumsprozesses bei ± 2 %. Daher wurde die Anzahl der Punkte des CM30 Systems als ausreichend erachtet, um den Status der Zellen im gesamten Gefäß einzuschätzen.

Zusätzlich zur Validierung der Mehrpunktbeobachtung überprüften wir dieselbe Methode, indem wir die Anzahl der Zellen an nur einem Beobachtungspunkt in einem Behälter zählten und anhand der Ergebnisse den Status der Zellen im gesamten Behälter schätzten (Abbildung 2). Wir stellten fest, dass in einer 12-Well-Platte ein Zählfehler von bis zu 60 % und in einer T75-Flasche ein Zählfehler von bis zu 129 % auftrat.

Um zu überprüfen, ob dieses Ergebnis auf eine ungleichmäßige Aussaat der Zellen zurückzuführen ist, haben wir den Grad der Variation der Zellanzahl in den verschiedenen Gefäßen der T75-Flasche in einer Heatmap dargestellt (Abbildung 3). Gelb kennzeichnet Zellbereiche mit mehr als 25 % mehr Zellen im Vergleich zur durchschnittlichen Gesamtzahl der Zellen, und hellblau kennzeichnet Bereiche mit weniger als 25 % der Zellen. Die rote Linie kennzeichnet den CM30 Mehrpunktbeobachtungsbereich (T75-Flasche), die orange Linie zeigt den Bereich, in dem die meisten Zellen detektiert wurden, und die blaue Linie zeigt den Bereich, in dem die wenigsten Zellen detektiert wurden.

Die Ergebnisse der Überprüfung zeigen, dass selbst eine einigermaßen erfahrene Person, die routinemäßig Zellkulturen anlegt, diese Art von Abweichungen bei der Aussaat bisweilen feststellt. Sie zeigt auch, dass das Risiko bei einer Gesamtschätzung sehr hoch ist, wenn ein einzelner Beobachtungspunkt von einem Bereich abgedeckt wird, der von der durchschnittlichen Anzahl der Zellen in der gesamten Flasche abweicht.

Abbildung 3: Heatmap mit dem Grad der Variation der Anzahl der Zellen in einer T75-Flasche

Wie oben gezeigt, treten Unregelmäßigkeiten bei der Aussaat mit einer gewissen Häufigkeit auf. Die Schätzung des Zellstatus des gesamten Gefäßes anhand eines einzigen Beobachtungspunktes birgt ein hohes Risiko, Ergebnisse zu erhalten, die erheblich von der tatsächlichen Zellanzahl abweichen, auch dann, wenn es keine größeren Probleme bei der Kultivierung der Zellen gibt. Dies zeigt, dass es schwierig ist, von einem einzelnen Beobachtungspunkt aus quantitative Daten mit hoher Reproduzierbarkeit zu erhalten. Wird beispielsweise eine Überwachungsvorrichtung verwendet, die auf einen einzigen Beobachtungspunkt beschränkt ist, müssen mehrere Punkte betrachtet werden, indem die Behälterposition jedes Mal verschoben wird, um den Zellzustand im gesamten Behälter zu quantifizieren.
 

Zusammenfassung

Unsere vergleichende Validierung des CM30 Systems zeigt, dass es möglich ist, quantitative Daten, die der tatsächlichen Zellanzahl des gesamten Behälters nahe kommen, aus dem Durchschnitt der Zellanzahl von mehreren Punkten zu schätzen, ohne den gesamten Behälter betrachten zu müssen. Dies belegt die Validität der Schätzung des gesamten Behälters von mehreren Punkten aus. Wenn man bedenkt, dass eine gewisse Anzahl von Unregelmäßigkeiten bei der Aussaat auftritt, selbst wenn der Bediener einigermaßen geübt ist, birgt die Schätzung der Zellanzahl des gesamten Behälters ausgehend von einem einzigen Betrachtungspunkt ein hohes Risiko, Daten zu erhalten, die erheblich von der tatsächlichen Zellanzahl abweichen.

Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass quantitative Daten, die durch Mehrpunktbeobachtung mit dem CM30 System gewonnen werden, eine zuverlässige Zellqualitätskontrolle ermöglichen. Sie weisen auch darauf hin, dass selbst bei einer einfachen Überprüfung des Zellstatus ein gewisses Maß an Unregelmäßigkeiten bei der Aussaat berücksichtigt und eine Mehrpunktbeobachtung durchgeführt werden muss.

Zusätzlich zu den oben genannten Analysemethoden wurde das CM30 System aktualisiert, um die Zellzählung, die Bestimmung der Konfluenz und andere Analysefunktionen zu verbessern. Die Genauigkeit der KI-basierten Analyse wurde außerdem durch das Hinzufügen detaillierterer Einstellungen für jeden Analyseparameter verbessert. Da das CM30 System auf Effizienz und Reproduzierbarkeit ausgelegt ist, indem es Kulturbedingungen quantitativ überwacht und gleichzeitig die Variabilität der Beurteilung durch eine menschliche Person minimiert, ist es eine optimale Lösung für Zellkulturprozesse mit einer großen Anzahl an täglichen Aufgaben.
 

Autor

Masatoshi Dehari
Life Science Research Solutions, Global Marketing
Evident