SilVIR Detektorsystem der nächsten Generation für das konfokale Lasermikroskop FLUOVIEW FV4000

Abstract

Mit dem proprietären SilVIR Detektorsystem der nächsten Generation für das konfokale Lasermikroskop FV4000 hat Evident neue Wege beschritten. Dieser Detektor setzt neue Maßstäbe im Multicolor-Imaging und bietet außergewöhnlich geringes Rauschen und hohe Empfindlichkeit mit einem hervorragenden Signal-Rausch-Abstand im sichtbaren bis Nah-Infrarot-Wellenlängenbereich. Durch seine präzise Photonenerkennung mit schneller HDR-Photonenzählung verbessert der SilVIR Detektor die Wiederholbarkeit von Experimenten. Zudem ist er anwenderfreundlich, da die bei PMT-Detektoren üblicherweise erforderlichen Verstärkungseinstellungen entfallen. Mit seiner hervorragenden Leistung ist der SilVIR Detektor auf dem besten Weg, zum neuen Standard in der Laser-Scanning-Mikroskopie zu werden.
 

1. Einführung

Photomultiplier-Röhren (PMTs) können schwaches Licht auf mehreren Photonenebenen mit hoher Empfindlichkeit und hoher Verstärkung erkennen. Daher galten sie bislang als Standarddetektoren in der Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) zur Erfassung von sehr schwachem Fluoreszenzlicht. Es gibt jedoch eine Reihe von Problemen im Zusammenhang mit LSM und PMTs, die in den folgenden Abschnitten erläutert werden.

Das SilVIR Detektorsystem verwendet einen Halbleitersensor zur Erkennung von Fluoreszenz. Mit diesem Silizium-Photomultiplier (SiPM) lassen sich viele der Probleme und Einschränkungen herkömmlicher PMTs umgehen. Zudem verfügt die Signalverarbeitungsschaltung über eine Technologie, die die Leistung des Sensors maximiert und seine Anwendbarkeit auf Bildgebung mit hoher Pixelzahl und hoher Geschwindigkeit erweitert (Abbildung 1).

In diesem Whitepaper geht es darum, welche Probleme bei der konventionellen LSM-Bildgebung mit PMT-Detektoren auftreten können und wie sie mit dem SilVIR Detektor umgangen werden.

_{Abbildung 1: Geräte mit SilVIR Detektor: (a) FV4000 Fluoreszenzdetektor; (b) Diagramm der spektralen Empfindlichkeit des SilVIR Detektors: Der Detektor hat eine höhere Empfindlichkeit als herkömmliche hochempfindliche GaAsP-PMT zwischen 400 und 900 nm vom Breitbandtyp und rotverschobenen Typ; (c) Der SilVIR Detektor weist einen SiPM Sensor auf und bietet 1 GHz A/D-Sampling und digitale Signalverarbeitung.}
 

2. Anwender von Laser-Scanning-Mikroskopen wünschen sich einen besseren Detektor

Viele Anwender betrachten folgende Aspekte als Mängel bei der LSM:

• Unsicherheit dahingehend, welche Einstellungen anzupassen sind, um die Geräteleistung zu maximieren.
• Zu viel Photobleaching und Phototoxizität.
• Unbeabsichtigte Sättigung der Detektoren.
• Suboptimale Bildqualität, Auflösung und Bildrate.
• Keine Möglichkeit zur Aufnahme besserer Bilder.

Grundursache dieser Mängel ist der PMT-Detektor mit seiner grundlegenden Funktionsweise. Im Folgenden sind einige der Faktoren erläutert, die wir bei der Entwicklung eines besseren Detektors berücksichtigt haben.

Hohe Empfindlichkeit und besserer Signal-Rausch-Abstand

Um bereits eine kleine Menge einfallender Photonen effizient zu erfassen, wie es für die Bildgebung mit schwachen Fluoreszenzsignalen erforderlich ist, muss der Detektor über eine hohe Quanteneffizienz (QE) und Photodetektionseffizienz (PDE) verfügen. Außerdem muss das immanente Rauschen des Sensors und des Detektorschaltkreises vernachlässigbar gering sein, um einen hohen Signal-Rausch-Abstand zu erreichen.

Quantifizierung des detektierten Lichts

Es gibt verschiedene Definitionen für die physikalische Messung von detektiertem Licht. Wenn es aber um die Quantifizierung von sehr schwachem Fluoreszenzlicht geht, stellt die Quantifizierung der „Photonenzahl“ die genaueste Methode dar. Die Intensität lässt sich demnach am einfachsten über die Anzahl der detektierten Photonen messen (Abbildung 2).

Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität anhand eines numerischen Werts ist sehr wichtig. Damit wird es beispielsweise möglich, dieselben Ergebnisse der Bildgebung auf verschiedenen Geräten zu reproduzieren, da es sich nicht um einen gerätespezifischen Wert handelt. Außerdem lassen sich wissenschaftliche Daten einfacher austauschen, da die Photonenanzahl einen universellen Wert darstellt. Nicht zuletzt können die quantitativen Werte als Indikator für die Vorverarbeitung von Bildern während der Analyse verwendet werden.

_{Abbildung 2: Der Fluoreszenzdetektionsprozess beginnt, wenn Photonen auf die Oberfläche des Photosensors treffen. Die detektierten Photonen werden dann in Elektronen umgewandelt, verstärkt und als elektrischer Strom ausgegeben. In der Amplifikationsschaltung wird der Strom von analog zu digital umgewandelt. Anschließend wird das digitalisierte Signal durch arithmetische Verarbeitung in einen Intensitätswert für jedes Pixel umgewandelt, bis schließlich die Wiedergabe jedes Pixels des Bildes durch die Software erfolgt.}

Hoher Dynamikbereich (High Dynamic Range, HDR)

Selbst wenn die oben genannten Punkte verwirklicht werden können, kommt es in den Bereichen mit hoher Fluoreszenzintensität zu einer Sättigung der Intensität und zu einem Verlust der Quantifizierbarkeit, wenn die maximale Anzahl der je Zeiteinheit detektierbaren Photonen, der sogenannte Dynamikbereich, niedrig ist. Eine weitere Möglichkeit zur Verbesserung der Bildqualität ist die Unterdrückung des Photonenrauschens (das probabilistische Rauschen der Photonendetektion auf dem Sensor, auch Schrotrauschen genannt), indem man die Anzahl der stark angeregten Emissionsphotonen erhöht. Bei einem hohen Dynamikbereich können Bilder von hoher Qualität ohne Sättigung der Helligkeit aufgenommen werden. Wie in Abbildung 3 dargestellt, ist die Bildqualität umso besser, je mehr Fluoreszenzlicht durch die stärkere Anregung erfasst wird (wie im Bild ganz rechts). Letztendlich wirkt sich die Sättigung der Detektoren jedoch auf viele Nachbearbeitungs- und Analyseschritte negativ aus.

Konsistente Detektorverstärkung für die Bildquantifizierung

Ideal wäre ein hoher Dynamikbereich, ohne die Bedingungen des Detektors oder der Schaltung zu verändern. Wenn z. B. die Detektorverstärkung geändert wird, um den oberen Bereich zu erweitern, verändert sich auch die Intensität des resultierenden Bildes. Diese Beziehung ist jedoch nicht linear, sodass es schwierig ist, die detektierte Lichtmenge invers allein anhand des resultierenden Bildes zu schätzen. Zur Korrektur muss separat eine Kalibrierkurve erstellt werden. Die Liniendiagramme in Abbildung 3 zeigen das Helligkeitsprofil entlang der Linie A auf jedem Bild. Bei Aufnahme dieser Bilder mit einer festgelegten Detektoreinstellung kann die detektierte Anzahl Photonen an jedem Pixel eines Bildes anhand der Intensität quantitativ geschätzt werden.

_{Abbildung 3: Der Zusammenhang zwischen Fluoreszenzintensität und Bildqualität. Der Signal-Rausch-Abstand wird durch die Fluoreszenzintensität/√Fluoreszenzintensität bestimmt.}
 

3. Probleme mit herkömmlichen PMT-Detektoren in der LSM-Bildgebung

Im Folgenden werden die Hauptprobleme bei der Verwendung eines PMT-Detektors in der Laser-Scanning-Mikroskopie besprochen.

Sowohl eine hohe Empfindlichkeit als auch einen hohen Signal-Rausch-Abstand zu erzielen ist schwierig

Derzeit ist es üblich, hochempfindliche GaAsP-Photokathoden-PMTs [1] als Detektoren zu verwenden, deren QE im sichtbaren Bereich auf 40 % oder mehr verbessert wurde. Wegen des von den Sensoren und Schaltungen ausgehenden Rauschens werden sie zur Amplifizierung des Signals generell mit einer höheren Verstärkung verwendet, um zu verhindern, dass das relative Rauschen das Bild beeinträchtigt. In PMTs werden Photonen zudem an der lichtempfangenden Oberfläche in Elektronen umgewandelt, woran sich ein stochastischer, mehrstufiger Amplifikationsprozess anschließt, um ein Stromsignal zu erzeugen (Abbildung 4). Daher ändert sich die Ausgabe aufgrund stochastischer Schwankungen jedes Mal, auch wenn die Anzahl detektierter Photonen konstant ist. Dadurch kann sich der Signal-Rausch-Abstand des Bildes verringern, insbesondere beim hochauflösenden High-Speed-Imaging mit weniger detektierten Photonen.

_{Abbildung 4: Charakteristika der Ein- und Ausgänge eines PMT. Wenn Photonen auf die Photokathode treffen, werden die von der Photokathode emittierten Elektronen in einer Vakuumröhre amplifiziert. Da Sekundärelektronen an mehreren Dynodenketten wiederholt amplifiziert werden, ist das Ausgangspulssignal bei der Detektion eines Photons nicht gleichmäßig oder stabil.}

Geringe Quantifizierbarkeit der Intensität für detektierte Photonen

Wie bereits erwähnt, kommt es bei PMTs während der Photoelektronenamplifikation zu einer stochastischen Variation. Daher ist die Quantifizierbarkeit des Ein- und des Ausgangssignals gering, insbesondere wenn die Photonendetektionsrate niedrig ist. Außerdem kann zwar die Verstärkung durch Variation der zwischen den Elektroden angelegten Spannung angepasst werden, aber dadurch ändert sich auch das entsprechende Verhältnis von Ein- und Ausgangssignal. Auch wenn die gleiche Spannung angelegt wird, variiert die tatsächliche Verstärkung aufgrund individueller Unterschiede zwischen den einzelnen PMTs erheblich. Und wenn die angelegte Spannung auf einen niedrigen Wert eingestellt wird, um große Mengen an Photonen zu verstärken, verschlechtert sich die Linearität.[1]

Zudem führen die folgenden unvermeidlichen Phänomene dazu, dass sich die Empfindlichkeit von PMTs entsprechend der durch die Nutzung akkumulierten Photonen verschlechtert.

• Wenn Photonen in die Photokathode gelangen, werden aufgrund des externen photoelektrischen Effekts Elektronen von der Photokathode in die Vakuumröhre abgegeben. Da die Elektronen nicht vollständig ersetzt werden können, kommt es zu einer allmählichen Beeinträchtigung der Photokathode.
• Beeinträchtigung der Dynoden durch Kollision mit Elektronen (Photoelektronen), die von der Photokathode abgegeben werden.
• Beeinträchtigung der Photokathode oder der Dynoden durch Aufprall mit Ionen, die durch die Kollision von Photoelektronen mit Restgas oder Verunreinigungen in der Vakuumröhre entstehen.
• Abnahme des Vakuums aufgrund von Verunreinigungen infolge der Kollision zwischen Photoelektronen und Dynoden.

Aus diesem Grund ist bei LSMs mit PMTs keine Quantifizierbarkeit der detektierten Lichtmenge entsprechend der Bildintensität möglich.

Sowohl einen hohen Dynamikbereich als auch einen hohen Signal-Rausch-Abstand zu erzielen ist schwierig

Wenn die Sensorverstärkung erhöht wird, kann trotz des Rauschens noch ein schwaches Signal einiger weniger Photonen detektiert und somit ein hoher Signal-Rausch-Abstand erzielt werden. Die Obergrenze des Ausgangsstroms von PMTs liegt jedoch nur bei mehreren μA. Wenn die Verstärkung hoch ist, kommt es trotz der geringen Anzahl an Detektionsphotonen leicht zu einer Sättigung des Ausgangssignals und dadurch zu einem kleinen Dynamikbereich (Abbildung 5a). Ist die Verstärkung hingegen niedrig, ist das Ausgangssignal selbst bei starker Fluoreszenz (einer großen Anzahl Photonen) nicht gesättigt und der Dynamikbereich ist größer. Schwache Fluoreszenz, z. B. eine geringe Anzahl an Photonen, wird jedoch nicht amplifiziert und geht im Rauschen unter, wodurch sich der Signal-Rausch-Abstand verschlechtert (Abbildung 5b). Dies hat zur Folge, dass die Verstärkung des Detektors je nach der Helligkeit des Objekts und der gewünschten Bildqualität manuell eingestellt werden muss. Zudem besteht der Nachteil, dass sich durch diese Anpassung der Dynamikbereich und der Signal-Rausch-Abstand ungewollt verändern.

_{Abbildung 5: Eine Anpassung der Verstärkung von PMTs erfordert einen Abgleich des Signal-Rausch-Abstandes und des Dynamikbereichs; (a) hohe Verstärkung – das Ausgangssignal kann bei der Detektion eines Photons höher amplifiziert werden als das Rauschen, dadurch verringert sich aber der Dynamikbereich und es kommt leicht zu einer Sättigung; (b) geringe Verstärkung – das Ausgangssignal ist bei der Detektion einer geringen Anzahl von Photonen nicht von Rauschen unterscheidbar. Andererseits ist der Dynamikbereich größer und es tritt keine Sättigung ein, wenn eine große Anzahl Photonen erfasst wird.}

Komplexe Detektionseinstellungen

Die Anpassung der Detektoreinstellungen für eine zufriedenstellende Bildqualität bei gleichzeitiger Vermeidung einer Helligkeitssättigung ist komplex und daher schwierig für Anwender, die lediglich über LSM-Grundkenntnisse verfügen. Zur Veranschaulichung sind in Abbildung 6 fluoreszierende Beads mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten aufgrund unterschiedlicher Einstellungen der Detektorverstärkung gezeigt.

Abbildung 6a zeigt die Beads bei unterschiedlicher Anregung, aufgenommen mit hoher Verstärkung. Dunkle Beads sind selbst bei schwacher Anregung kaum von Rauschen unterscheidbar (Bild ganz links). Bei den hellen Beads trat dagegen bei Verstärkung des Anregungslichts eine Sättigung ein (die beiden Bilder rechts mit hellen Beads).

In Abbildung 6b sind dieselben Fluoreszenzbeads bei Aufnahme mit einer geringeren Verstärkung dargestellt. Das Signal der dunklen Beads bei schwacher Anregung (die beiden Bilder links) wurde vom Rauschen überdeckt. Das Ergebnis ist insofern dem Ergebnis bei hoher Verstärkung überlegen, als bei den hellen Beads keine Sättigung eintrat, auch nicht, wenn die Anregung auf die höchste Stufe eingestellt wurde (ganz rechts im Diagramm). Allerdings war der Signal-Rausch-Abstand bei den dunklen Beads nicht besser als im Bild ganz rechts in Abbildung 6a (mit hoher Verstärkung aufgenommenes Bild).

Typische Fluoreszenzbilder von Zellproben weisen erhebliche regionale Helligkeitsunterschiede auf, die bei Zeitraffer- oder Z-Stapelbildern sogar noch stärker ausgeprägt sein können. Selbst für erfahrene Bediener ist es schwierig, die optimalen Detektoreinstellungen zu finden, um Bilder mit einem zufriedenstellenden Signal-Rausch-Abstand in dunklen Bereichen zu erhalten, ohne die hellen Bereiche zu übersättigen. Oft wird bei Einstellung der Detektorverstärkung, der Intensität des Anregungslichts, der Belichtungsdauer usw. nach der Trial-and-Error-Methode vorgegangen, was aber dazu führen kann, dass viele fehlerhafte Bilder aufgenommen werden müssen, bis das Ergebnis schließlich wunschgemäß ist.

Wenn der Signal-Rausch-Abstand aufgrund von Detektoreinstellungen, die keine Sättigung verursachen, unzureichend ist, können Verbesserungen erzielt werden, indem mehrere Bilder aufgenommen und gemittelt oder kumuliert werden, um lediglich das zufällige Rauschen zu unterdrücken. In diesem Fall müssen viele Bilder aufgenommen werden, was zu einem erheblichen Rückgang der tatsächlichen Bildfrequenz führt.

Wie oben beschrieben, müssen bei der herkömmlichen LSM mit PMTs komplexe Bildgebungsparameter wie Detektorverstärkung, Anregungslichtintensität und Belichtungsdauer sowie die Anzahl der Mittelungszeiten zwischen den Bildern eingestellt werden.

_{Abbildung 6: Die Anpassung der Verstärkung einer PMT erfordert den Abgleich des Signal-Rausch-Abstandes und des Dynamikbereichs, was schwierig sein kann. Die Bilder wurden mit unterschiedlichen Anregungslasereinstellungen aufgenommen (höhere Einstellung bei den Bildern rechts). Die Diagramme unter den Bildern zeigen das Intensitätsprofil entlang der Linie A. Der Signal-Rausch-Abstand ist das Verhältnis von S (Profilhöhe) und Ns (Photonenrauschen) und Nd (Leitungsrauschen). Abbildung 6a zeigt Proben, die mit hoher Verstärkung erfasst wurden. Die dunklen Beads haben einen höheren Signal-Rausch-Abstand, aber die helleren Beads erscheinen gesättigt. Abbildung 6b zeigt Proben, die mit niedriger Verstärkung erfasst wurden. Die dunklen Beads haben einen geringeren Signal-Rausch-Abstand, aber die helleren Beads erscheinen nicht gesättigt.}

Probleme bei der Detektionsschaltung

Es gibt auch Probleme im Zusammenhang mit der Detektionsschaltung und den Sensoren. Da das Sensorsignal und seine Amplifizierungsschaltung Rauschen erzeugen, wird der Signal-Rausch-Abstand sehr niedrig, wenn das vom Analog-Digital-Wandler (AD) abgetastete Ausgangssignal als Pixeldaten verarbeitet wird (Abbildung 7a, links). Generell kann dieser Signal-Rausch-Abstand so verbessert werden, dass er dem tatsächlichen Wert der Fluoreszenzintensität entspricht, indem das Signal nach Glättung mit einem Tiefpassfilter oder Integrator in der analogen Detektionsschaltung aufgenommen wird (Abbildung 7a, rechts). Je höher jedoch die Scangeschwindigkeit ist, wie bei einem Resonanzscanner, desto schneller wird die Struktur der Probe abgetastet. Abbildung 7b zeigt das Fluoreszenzbild derselben Struktur wie in Abbildung 7a, außer dass diese mit der doppelten Geschwindigkeit im Vergleich zu Abbildung 7a gescannt wurde. Wenn ein Tiefpassfilter zur Rauschunterdrückung auf die gleiche Weise angewendet wird, reicht die zeitliche Auflösung nicht aus, um die feinen Strukturen mit hoher Raumfrequenz aufzulösen, und die räumliche Auflösung des resultierenden Bildes verschlechtert sich (Abbildung 7b, rechts).

Die zeitliche Auflösung verbessert sich, wenn die Grenzfrequenz der Tiefpassfilter erhöht wird. Allerdings nimmt die Effektivität der Rauschunterdrückung ab und der Signal-Rausch-Abstand verschlechtert sich. Um das zu verhindern, selbst wenn die Grenzfrequenz der Tiefpassfilter erhöht wird, muss die Samplingrate des AD-Wandlers auf ein Vielfaches des Pixeltaktes erhöht werden, um sehr viele Samplings innerhalb eines Pixels durchzuführen (Oversampling). Außerdem verkürzen die schnellere Scangeschwindigkeit und die höhere Pixelzahl die Verweildauer je Pixels, was den Grund dafür darstellt, warum eine höhere Samplingrate der AD-Wandler erforderlich ist.

Ein weiteres Problem hinsichtlich der Rauschglättung besteht darin, dass bei einer analogen Schaltung nur ein einfacher Filter, z. B. ein Tiefpassfilter, verwendet werden kann, was die zeitliche Auflösung beeinträchtigt. Daher wäre eine Filtermethode wünschenswert, die nur das Rauschen herausfiltert, ohne die zeitliche Auflösung zu beeinträchtigen, indem erweiterte digitale Signalverarbeitungsfilter auf die mit hoher Geschwindigkeit abgetasteten Daten angewendet werden.

_{Abbildung 7: Die Auswirkung der Rauschreduzierung auf die Bildqualität und räumliche Auflösung. Abbildung 7a wurde mit Standard-Scangeschwindigkeit aufgenommen und die Bildqualität wurde durch Reduzierung des Rauschens verbessert. Abbildung 7b wurde mit einer doppelt so hohen Scangeschwindigkeit wie in 7(a) aufgenommen; die Verschlechterung der räumlichen Auflösung aufgrund des Abfalls der Signalbandbreite ist gut zu erkennen.}

Mit unserem SilVIR Detektor, in dem ein neuer SiPM-Halbleitersensor mit digitalem High-Speed-Sampling kombiniert ist, können die genannten PMT-bedingten Probleme beim LSM-Imaging gelöst werden. Im nächsten Abschnitt wird erläutert, wie wir dies mithilfe unserer fortschrittlichen Technologien erreicht haben.
 

4. Technische Informationen zum SilVIR Detektor

4-1. SiPM-Funktionen

Der SiPM-Sensor, das Herzstück des SilVIR Detektors, ist ein Halbleitersensor aus einem zweidimensionalen Array aus Tausenden von Avalanche-Photodioden (APDs; Single-Photon Counting Avalanche Photodiode oder SPAD) , die im Geiger-Modus arbeiten. Die erkannten Signale werden als Summe aller APDs ausgegeben [2] (Abbildung 8).

Der Geiger-Modus ermöglicht die Detektion des Einfalls bereits eines Photons bei hohen Signalpegeln durch einen äußerst stabilen Multiplikationsprozess trotz hoher Verstärkung. Zudem ermöglicht der Halbleiterherstellungsprozess eine präzise Kontrolle über die einzelnen Variationen der SiPMs. Durch konsequente Massenproduktion können Differenzen in der Photodetektionseffizienz (PDE) und der Verstärkung zwischen SiPMs auf ein Minimum reduziert werden. Auch bei einem Einfall vieler Photonen gleichzeitig wird die Summe der jeweiligen APD-Ströme vom SiPM ausgegeben, sodass die Obergrenze des Ausgangsstroms hoch ist. Dies wiederum führt zu einem großen Dynamikbereich zur Detektion einer großen Anzahl einfallender Photonen. Mit anderen Worten: Ein Photonensignal kann mit hoher Verstärkung vervielfacht werden und der Detektionsbereich ist groß. So werden ein hoher Signal-Rausch-Abstand und gleichzeitig ein großer Dynamikbereich erreicht, ohne dass ein Kompromiss zwischen diesen beiden Eigenschaften durch Veränderung der Verstärkung eingegangen werden muss.

Zudem wird bei der photoelektrischen Umwandlung durch einen SiPM, wie bei Photodioden, der interne photoelektrische Effekt genutzt, bei dem Elektronen aus dem Valenzband zum Leiter angeregt werden. Daher werden angeregte Elektronen schnell wieder ersetzt. Das Ergebnis ist, dass die Empfindlichkeit und die Verstärkung nicht beeinträchtigt werden, auch nicht bei starkem Lichteinfall.

_{Abbildung 8: Aufbau eines Silizium-Photomultiplier(SiPM)-Sensors und Charakteristika seiner Ein- und Ausgänge. Abbildung 8(a) zeigt, dass ein SiPM aus Multipixel-APDs besteht. Wenn ein Photon auf die Photonenempfänger-Fläche der APD trifft, wird das Stromsignal durch die interne photoelektrische Umwandlung und die anschließende Avalanche-Elektronenamplifikation in der Avalanche-Schicht ausgegeben. Abbildung 8(b) zeigt, dass beim gleichzeitigen Einfall mehrerer Photonen das Ausgangssignal die Summe des APD-Signals ist. Die Wellenform des APD-Ausgabesignals als Reaktion auf das detektierte Photon ist konstant und stabil.}  

Zudem verfügt der SiPM-Sensor über hervorragende Empfindlichkeit. Abbildung 1b zeigt die spektrale Empfindlichkeit des SiPM-Sensors. Mit einer Kombination von SiPM-Sensoren mit unterschiedlichen spektralen Empfindlichkeiten, die wir als Breitband-Siliziumdetektor (BSD) und rotverschobenen Siliziumdetektor (RSD) bezeichnen, lässt sich eine bessere Empfindlichkeit als bei einem GaAsP-PMT-Detektor im sichtbaren bis Nah-Infrarot-Wellenlängenbereich (400 nm bis 900 nm) erzielen. Die Photonendetektionseffizienz (PDE) des SiPM ist durch folgende Gleichung definiert:

PDE = QE × FF × AP

QE: Quanteneffizienz
FF: Apertureffizienz (Füllfaktor)
AP: Wahrscheinlichkeit des Geiger-Modus (Avalanche-Wahrscheinlichkeit)

Die FF wird durch die Fläche der APD auf der SiPM-Photonenempfänger-Fläche im Verhältnis zur Fläche der Totzone zwischen APD-Pixeln bestimmt. Die AP hängt von der an das SiPM angelegten Spannung ab; je höher die Spannung, desto höher die erreichbare PDE. Allerdings führt eine Erhöhung der angelegten Spannung auch zu einem stärkeren Rauschen des Sensors. Beispielsweise kann die PDE durch Erhöhung der Überspannung beim Modell S13360-3050 von Hamamatsu Photonics (Spannung oberhalb der Durchbruchspannung) von 3 V auf 7 V um etwa das 1,4-Fache erhöht werden, aber das Dunkelzählrauschen nimmt um etwa das 2-Fache, das Übersprechrauschen um mehr als das 2-Fache und das Nachpulsrauschen um mehr als das 3-Fache zu [2]. Durch dieses verstärkte Rauschen werden die Vorteile der erhöhten PDE aufgehoben und folglich wird der Signal-Rausch-Abstand nicht verbessert. Zudem beeinträchtigt das verstärkte Rauschen die Quantifizierbarkeit der Photonendetektion (einer der wichtigsten Vorteile von SiPMs) erheblich. Da außerdem die Verstärkung um den Faktor zwei oder mehr erhöht wird, wird der dynamische Detektionsbereich kleiner. Dieses Beispiel für die potenziellen Schwierigkeiten einer ausschließlichen Konzentration auf hohe PDE- oder QE-Werte veranschaulicht, dass dies nicht in jedem Fall wünschenswert ist und ungewollte Auswirkungen haben kann. Daher wird in dem konfokalen Mikroskop FV4000 ein SiPM mit optimaler Überspannung verwendet, um Ausgewogenheit zwischen Rauschen und Empfindlichkeit sowie einen hervorragenden Dynamikbereich für die Fluoreszenzdetektion zu erreichen.

Dass ein SiPM ein höheres Dunkelzählrauschen aufweist als ein PMT wird oftmals als Nachteil angeführt. Als Gegenmaßnahme wird die Photonenempfänger-Fläche auf etwa -20 °C gekühlt, um das Dunkelzählrauschen auf einen Kilocount-Wert im einstelligen oder zweistelligen Bereich pro Sekunde zu reduzieren. Das ist aber immer noch höher als bei gekühlten PMTs. Wird jedoch ein SiPM mit einem Dunkelzählrauschen von 10 Kilocounts pro Sekunde für das Scannen mit 512 Pixel/Linie bei einer Verweilzeit von 2 µs/Pixel verwendet, tritt ein Dunkelzählrauschen, das 1 Photon entspricht, nur bei etwa 10 Pixel/Linie auf. Bei diesem Wert ergeben sich nur geringe Auswirkungen auf die LSM-Bildqualität.

Ein weiterer Nachteil der Verwendung eines SiPM als LSM-Detektor besteht darin, dass das Ausgangssignal eine Zerfallskurve mit langem Endstück (Tail) aufweisen kann (Abbildung 8). Dies führt zu Problemen beim High-Speed-Imaging. Wie im nächsten Abschnitt beschrieben, konnten wir dieses Problem durch Implementierung einer innovativen Detektionsschaltungslösung jedoch erfolgreich lösen.

4-2. High-Speed-Sampling und digitale Verarbeitungsfunktionen

Wie bereits beschrieben, wird bei konventionellen Systemen ein Abgleich zwischen dem Signal-Rausch-Abstand und der zeitliche Auflösung vorgenommen, indem die Signalglättung mittels analoger Schaltungsfilterung mit der kleinsten, für die Pixelauflösung erforderlichen AD-Samplingfrequenz (eine Samplingdauer von etwa der Hälfte der Pixelperiode) kombiniert wird. Diese Lösung war jedoch technisch auf die Reaktion auf die höhere Pixelzahl (kürzere Pixelperiode) des Hochgeschwindigkeits-Resonanzscanners begrenzt (Abbildung 9a).

Hochgeschwindigkeits-AD-Sampling

Wir haben eine AD-Samplingrate von 1 GHz realisiert (12-mal schneller als die herkömmliche Samplingrate) und ein Oversampling-Verfahren angewandt, bei dem eine große Anzahl von Samplings innerhalb einer Pixelperiode durchgeführt wird. Aufgrund des großen Dynamikbereichs des Ausgangssignals eines SiPM-Sensors ist auch die Signalstärke im Vergleich zu einem PMT sehr groß. Zusammen mit der höheren AD-Samplingrate ist die Genauigkeit der Amplitudenauflösung 16-mal höher (von 10 Bit auf 14 Bit) als bei herkömmlichen Geräten. Diese Hochleistungsgeräte sind für SiPM-Signalverarbeitungsanwendungen optimiert. Bei der Rauschunterdrückung wird ein digitaler Signalverarbeitungsfilter anstelle eines analogen Filters verwendet, der das Rauschen effizient dämpft und gleichzeitig die Signalbandbreite minimiert, um einen höheren Signal-Rausch-Abstand zu erzielen. So können hochfrequente Komponenten, die mit der herkömmlichen Methode nicht getrennt werden können, getrennt erfasst werden, und es lässt sich eine ausreichende Pixelauflösung (zeitliche Auflösung) erreichen, selbst wenn die Pixelzahl des Resonanzscanners 1k oder mehr beträgt (Abbildung 9b).

_{Abbildung 9: Auswirkungen einer verbesserten Rauschunterdrückung auf Bildqualität und räumliche Auflösung. Abbildung 9(a) zeigt das herkömmliche Verfahren mit einem analogen Schaltungsfilter und langsamer Samplingrate. Die räumliche Auflösung wird aufgrund des Abfalls der Signalbandbreite bei schnellem Scannen beeinträchtigt. Abbildung 9(b) zeigt eine Kombination aus High-Speed-Sampling und digitaler Rauschunterdrückung während eines Hochgeschwindigkeitsscans unter Beibehaltung der räumlichen Auflösung.}

Inverse Transformation in Echtzeit am Field Programmable Gate Array (FPGA) zur Eliminierung der Signalabschwächung

Wir haben darüber hinaus eine Technik entwickelt, mit der die Bandbreitendegradation aufgrund einer langsamen Signalabschwächung (ein Nachteil von SiPM-Sensoren) durch den Einsatz fortschrittlicher Signalverarbeitung in einem FPGA (Field Programmable Gate Array) ohne Einschränkungen rückgängig gemacht werden kann. Zur Eliminierung des Abklingsignals gibt es eine bekannte Force-Resetting-Methode [3]. Mit unserer Methode kann jedoch das Ausgangssignal mit höherer Geschwindigkeit wiederhergestellt werden, d. h. ohne die komplizierte Detektionsschaltung, die bei der herkömmlichen Technik erforderlich ist.

Auch wenn ein SiPM-Sensor den Zeitpunkt der Photonendetektion und die Anzahl der detektierten Photonen genau und schnell ausgeben kann, gibt es einen Nachteil: die langsame Abschwächung des Ausgangssignals. Bei der Bildgebung mit einem Resonanzscanner führt die kurze Pixel-Verweildauer dazu, dass ein Abklingsignal in benachbarte Pixel übergeht, wodurch sich die Pixelauflösung und die zeitliche Auflösung verschlechtern (Abbildung 10a).

Bei der Verwendung eines SiPM-Sensors entspricht das Ausgangssignal insgesamt der Summe der Ausgangssignale der einzelnen APDs, und die als Reaktion auf den Photoneneinfall der einzelnen APDs erzeugte Pulswellenform ist sehr stabil und behält im Vergleich zu einem PMT eine konstante Form bei. Wenn die Reaktion auf den Eingang eindeutig definiert werden kann, lässt sich das Ausgangssignal am Ende durch die Konvolutionsumme der Reaktion auf den Eingang ermitteln. Unter der Annahme, dass der Zeitpunkt der Photonendetektion und die Photonenzahl in Abbildung 10b x(t) und die Reaktion des Sensors h(t) ist, entspricht das Ausgangssignal y(t) folgender Gleichung:

y(t)=(x*h)(t)=∑x(i)h(t-i)

Wenn das SiPM-Ausgangssignal y(t), einschließlich des Abklingsignals, gemessen wird und das Sensorsignal h(t) definiert werden kann, kann das Photonendetektionsereignis x(t), das kein Abklingsignal enthält, mit dieser Inversionsmethode berechnet werden. Dies basiert auf demselben Konzept wie das eines Dekonvolutionsfilters [4], der häufig zur Eliminierung des Abklingsignals eingesetzt wird, beispielsweise bei der quantitativen Analyse von Streusignalen bei der Kalziumionendynamik in den Neurowissenschaften. Das FPGA verfügt über einen schnellen erweiterten digitalen Signalprozessor (DSP), der die Echtzeitverarbeitung von Berechnungen der Inversionsmethode im Gerät ermöglicht. Wir haben eine Technik entwickelt, um die Ausgangsdaten des am FPGA invers transformierten Sensorsignals in Echtzeit zu erhalten [5], wie in Abbildung 10c dargestellt.

Durch die Berechnung der Pixelintensität mithilfe dieser invers transformierten Datensequenz haben wir den Übergang des Abklingsignals in benachbarte Pixel eliminiert, wie in Abbildung 10a dargestellt. Zudem entfernen die Restaurationsfilter nicht nur das Abklingsignal, sondern isolieren auch vermischtes Rauschen, was sich vom ursprünglichen Photonendetektionssignal unterscheidet. Dadurch wird der Signal-Rausch-Abstand des Signals weiter verbessert.

_{Abbildung 10: Überblick über das Verfahren zur Umkehrung der Bandbreitenverschlechterung aufgrund der Abschwächung des SiPM-Abklingsignals. Abbildung 10(a) zeigt das Abklingsignal des Sensors und die Verschlechterung der räumlichen Auflösung; Abbildung 10(b) zeigt die Beziehung zwischen Eingangs- und Ausgangssignal des SiPM-Sensors; und Abbildung 10(c) zeigt die Schätzung des Eingangssignals durch Dekonvolution.}

Wie in Abbildung 11 dargestellt, wird die Auflösung der Bildpixel ohne inverse Transformation durch den Effekt des SiPM-Abklingsignals beeinträchtigt, insbesondere beim Resonanz-Scannen mit hoher Geschwindigkeit und hoher Auflösung. Durch Anwendung der Inversionsmethode wird die zeitliche Auflösung ohne Reduzierung des Photoneneingangssignals wiederhergestellt, sodass ein hochauflösendes Bild des Resonanzscanners (1024 Pixel/Zeile) ohne Verlust der räumlichen Auflösung oder detektierter Photonen erzielt werden kann.

_{Abbildung 11: Beispielabbildung einer BPAE-Zelle (Actin (BODIPY FL)) mit und ohne inverse Transformation; resonant, Mittelwert 64, Anr. 488 nm, Em. 500–540 nm, gleiche Anregungsleistung; UPLSAPO40x2/NA 0,95, CA 1 AU, 1024 × 1024 Pixel.}

HDR-Photonenzählung

Bei einem SiPM besteht die Tendenz, dass sich das ausgegebene Rohsignal aufbaut, wenn hochfrequente Photonendetektionszahlen auftreten, zum Beispiel bei Detektion weiterer Photonen vor dem Abklingsignal (die blaue Linie in Abbildung 11). Um den hohen Dynamikbereich (HDR) eines SiPM nutzen zu können, muss der Umwandlungsmaßstab des AD-Wandlers daher größer sein als die Signalamplitude der Hochfrequenz-Photonendetektion einschließlich des Pile-up-Effekts. Andererseits muss die Signalamplitude eines einzelnen Photons, also des kleinsten Signals, mit einer feinen Auflösung erfasst werden, um die inverse Transformation präzise durchzuführen. Daher ist ein AD-Wandler mit höherer Auflösung erforderlich, um kleinere Amplituden mit feinerer Auflösung und größere Pile-up-Amplituden zu erfassen. Zudem ist die inverse Transformation ohne eine sehr hohe Zeitauflösung, d. h. viele digitale Datensequenzen, die mit hohen Samplingraten erfasst werden, nicht möglich. Im Allgemeinen verfügen AD-Wandler mit einer Samplingrate von 1 GHz für High-Speed-Geräte über eine Auflösung von 8 Bit. Wir haben diese inverse Transformation jedoch durch die Verwendung von High-End-AD-Wandlern mit einer Abtastrate von 1 GHz, einer Auflösung von 14 Bit (16.384 Abstufungen) und einer Hochgeschwindigkeitsverarbeitung der von diesen Wandlern erhaltenen digitalen High-Speed-Datenmengen mit einem High-End-FPGA erreicht.

Das invers transformierte Signal (die orangefarbene Linie in Abbildung 11) wird wiederhergestellt, wobei die zeitliche Auflösung durch Entfernen des Abklingsignals erhalten bleibt. Durch Glättung der aufgebauten Signale kann die Pulsausgangsamplitude (Wellenspitzenwert) entsprechend der detektierten Photonenzahl ermittelt werden. Mit anderen Worten: Wenn ein einzelnes Photon detektiert wird, werden die Pulse mit derselben Amplitude ausgegeben. Entsprechend werden bei der gleichzeitigen Detektion zweier Photonen Pulse mit doppelt so hoher Amplitude ausgegeben. Werden danach gleichzeitig Photonen entdeckt, werden die Pulse mit einer Amplitude ausgegeben, die ein ganzzahliges Vielfaches dieses einen Photons ist. Wenn also N Photonen innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls erfasst werden, kann die zeitliche Integration dieser Ausgangspulse als integrierte Intensität des N-Fachen des Pulses zum Zeitpunkt der Detektion des einzelnen Photons ermittelt werden. Dieser Zusammenhang gilt auch dann, wenn innerhalb kürzester Zeit eine große Photonenzahl detektiert wird.

Folglich ermöglicht diese Methode die genaue Detektion von fluoreszierendem Licht, auch wenn eine große Photonenzahl in kurzer Zeit erfasst wird, mit einem Signal-Rausch-Abstand, mit dem Photonen diskret erfasst werden können. Mit diesem Signal-Rausch-Abstand kann bis zu 1 Giga Photonen pro Sekunde ohne Sättigung detektiert werden. Während die herkömmliche Zählung einzelner Photonen (paralysiert oder nicht-paralysiert) [1] nur bei niederfrequenten Photonendetektionsraten angewandt werden konnte, erreicht die hier vorliegende Technologie eine HDR-Photonenzählung, die, was den Signal-Rausch-Abstand anbelangt, mit der Einzel-Photonenzählungs-Detektionsmethode vergleichbar ist, selbst wenn sehr helle Proben mit hoher Geschwindigkeit dargestellt werden (Abbildung 12).

_{Abbildung 12: Zusammenhang zwischen der Anregungsintensität und Ausgangssignal. Es kann eine größere Photonenzahl pro Zeiteinheit bei Erhöhung der Anregungsleistung erfasst werden. Bei Verwendung einer herkömmlichen Photonenzählmethode wird das Ausgangssignal bei einer niedrigen erfassten Photonenrate gesättigt. Mit dem SilVIR Detektor tritt dagegen selbst bei einer hochfrequenten Photonenrate keine Sättigung bei der HDR-Photonenzählung ein. Die Kurven der Einzelphotonenzählung wurden mit einer Pulspaarauflösung von 1,2 ns berechnet.}

4-3. Vorteile des SilVIR Detektors

Das SilVIR Detektorsystem ist eine Kombination aus SiPM-Sensor und digitaler Hochgeschwindigkeitsverarbeitung. Im obigen Abschnitt haben wir die ideale LSM-Fluoreszenzdetektion sowie den Status herkömmlicher LSM und ihre Abweichungen vom Ideal beschrieben. Mit dem SilVIR Detektor konnten wir jedoch eine nahezu ideale LSM-Fluoreszenzdetektion realisieren.

Hohe Empfindlichkeit und hoher Signal-Rausch-Abstand

Ein ideales Detektionssystem sollte eine hohe Photonendetektionseffizienz (PDE) und kein Rauschen des Sensors oder der Leitung aufweisen.

Durch Verwendung von zwei Arten von SiPM-Sensoren erreicht der SilVIR Detektor eine höhere PDE im sichtbaren Bereich und im NIR-Bereich, ohne dass Kompromisse zwischen dem dynamischen Bereich und dem Signal-Rausch-Abstand eingegangen müssen. Zudem dominiert im SilVIR Detektor das Photonen-Schrotrauschen, da das Leitungsrauschen bis auf das Ein-Photonen-Level oder weniger unterdrückt wird und der Dunkelstrom unwesentlich klein ist. Somit kann der ungefähre Signal-Rausch-Abstand aus der Anzahl detektierter Photonen mit folgender Gleichung geschätzt werden:

Signal-Rausch-Abstand = N/√N = √N

N: Anzahl detektierter Photonen

Da der Signal-Rausch-Abstand leichter quantifizierbar ist, kann die Anzahl detektierter Photonen ein nützlicher Indikator für den Austausch und die Diskussion von Bildern sowie für die Reproduktion der Bildqualität in einem Bildgebungsexperiment sein.

Quantifizierbarkeit der detektierten Fluoreszenzintensität

Ein geeigneter Detektor kann die Menge der detektierten Fluoreszenz und die Intensität auf einer quantitativen Skala in Beziehung setzen. Mit herkömmlicher Technologie war dieses Verhältnis unklar und unsicher. Der SilVIR Detektor ist jedoch in der Lage, die Menge der erkannten Fluoreszenz anhand einer klaren quantitativen Skala (der Anzahl Photonen) zu quantifizieren.

Großer dynamischer Bereich

Ein geeigneter Detektor sollte einen großen Dynamikbereich haben, um sowohl ein einzelnes Photon als auch Tausende von Photonen erfassen zu können. Mit herkömmlicher Technologie ist dieser Bereich jedoch klein, wenn die Verstärkung hoch ist, und groß, wenn die Verstärkung niedrig ist, was Kompromisse zwischen zwischen Signal und Rauschen erforderlich macht. Die hohe Verstärkung des SilVIR Detektors ermöglicht die Erfassung einzelner Photonen, während sein großer Dynamikbereich die Erkennung tausender Photonen in kurzer Zeit ermöglicht.

Einfache Detektionseinstellungen (feste Verstärkung)

Die Einstellung eines Detektors sollte nicht kompliziert sein. Die konventionelle Technik macht es jedoch erforderlich, dass der Anwender die Hochspannung kontinuierlich an die Helligkeit der Fluoreszenz anpassen muss. Beim SilVIR Detektor hingegen müssen lediglich die Scangeschwindigkeit, die Pixelgröße und die Anzahl der Frame-Integrationen (oder Mittelungen) eingestellt werden.

Das Intensitätshistogramm eines Bildes, wie das in Abbildung 13, zeigt, dass der SilVIR Detektor das Fluoreszenzsignal bei einem hohen Signal-Rausch-Abstand diskret und quantitativ erfassen kann. In Abbildung 13 erscheint die Intensität mit kammartigen Peaks, und die Intensität der meisten Pixel konzentriert sich auf Intensitätswerte, die diesen Peaks entsprechen. Jeder Peak entspricht der Anzahl detektierter Photonen, die, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, anhand des Peakwerts des Pulssignals identifiziert wurden. Wenn beispielsweise der Peakwert des an einem bestimmten Pixel erfassten Pulssignals nur 1 Photon beträgt, entspricht die Intensität des Peaks 1 Photon, und wenn der Peakwert des erfassten Pulses an einem bestimmten Pixel 2 Photonen beträgt, entspricht die Intensität des Peaks 2 Photonen. Auch wenn die Anzahl der detektierten Photonen zunimmt, wird der Intensitätswert in die Peakposition des detektierten Photons umgewandelt. Da dieser Prozess naturgemäß mit gewissem Rauschen und gewissen Fehlern behaftet ist, akkumulieren sich diese Fehler, wenn eine hohe Anzahl Photonen erfasst wird, und die kammartigen Peaks sind bei hoher Intensität schwer aufzulösen. Da jedoch das Rauschen und die Fehler auf einen Wert kleiner als die Intensität eines Photons unterdrückt werden, weist das Histogramm dennoch kammartige Peaks von diskret detektierten Photonen auf. Wenn wir die Intensitätsverteilung unter der Annahme simulieren, dass sie Rauschen mit einer Standardabweichung von etwa 1/3 der Detektionsintensität eines Photons enthält, können tatsächlich Peaks, die höher sind als drei oder vier Photonen, nicht aufgelöst werden.

Somit kann ein Photon, die kleinste Quanteneinheit des Lichts, bei einem ausreichenden Signal-Rausch-Abstand getrennt vom Rauschen erfasst werden. Das bedeutet, dass sich die Intensität des Bildes nur aus der Intensität zusammensetzt, die der Anzahl der an jedem Pixel erkannten Photonen entspricht, und dass die Wirkung von Verunreinigungsrauschen vernachlässigbar ist oder gar nicht erst erkannt wird. Mit anderen Worten: Der SilVIR Detektor kann Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Abstand erfassen, die den Bildern entsprechen, die mit der herkömmlichen Photonenzählmethode erhalten werden. Zudem ist mit dem SilVIR Detektor selbst bei der Abbildung hochintensiver Fluoreszenz mit hoher Geschwindigkeit eine Erkennung mit einem hohen Signal-Rausch-Abstand möglich, während die herkömmliche Photonenzählmethode nur bei der Erkennung geringer Fluoreszenzniveaus bei längerer Belichtung gut funktioniert. Diese Eigenschaften machen den SilVIR Detektor zu einem bahnbrechenden Detektor für die präzise Fluoreszenzbildgebung.

Im konfokalen Lasermikroskop FV4000 kann die Intensität auf der horizontalen Achse von Abbildung 13 in die Anzahl der detektierten Photonen umgewandelt und als Alternative zum Intensitätswert auf dem Bild angezeigt werden. Die Anzahl Photonen kann aus der Breite zwischen den kammartigen Peaks umgerechnet werden, da die Peaks gleich beabstandet sind. Der SilVIR Detektor ist so konzipiert, dass er bei der Erkennung von 1 Photon 32 Zähler (Counts) ausgibt, während bei der herkömmlichen Photonenzählung ein Photon einem Count entspricht. Mit unserer Methode kann ein erfasstes Bild einen gewissen Grad an Abstufung aufweisen, selbst wenn die Anzahl erfasster Photonen gering ist. Durch die Akkumulation oder Mittelung von Bildern mit niedriger Photonenzahl können wir daher den Signal-Rausch-Abstand verbessern und gleichzeitig vermeiden, dass die Photonenzahl-Information im Rauschen oder in Fehlern untergeht.

_{Abbildung 13: Mit dem FV4000 SilVIR aufgenommenes Fluoreszenzbild und das zugehörige Pixelintensitätshistogramm. Das Histogramm veranschaulicht die kammförmige Häufigkeitsverteilung bei der diskreten Detektion von Photonen.}
 

5. Beispielbilder des SilVIR Detektors

In diesem Abschnitt werden LSM-Bilder vorgestellt, die mit dem SilVIR Detektor aufgenommen wurden.

Vergleich mit Bildern, die mit einem GaAsP-PMT aufgenommen wurden

Abbildung 14 zeigt Bilder mit grüner Fluoreszenz, die mit einem SilVIR und mit einem GaAsP-PMT-Detektor aufgenommen wurden. Die Probe wurde mit der gleichen Laserleistung angeregt, um die typische Fluoreszenzintensität zu erreichen. Wenn die Intensität relativ hoch ist (etwa 128 Photonen) weisen beide Bilder eine ähnliche Bildqualität auf, aber der SilVIR Detektor liefert zusätzlich eine direkte Angabe der Photonenzahl.

_{Abbildung 14: Sowohl der SilVIR- als auch der GaAsP-PMT-Detektor können ein helles Probenbild mit einem äquivalenten Signal-Rausch-Abstand erfassen. Abbildung 14(a) wurde mit dem SilVIR Detektor aufgenommen, Abbildung 14(b) mit dem PMT bei 550 V. Es wurde die gleiche Probe mit der gleichen Laserleistung angeregt. Die maximale Fluoreszenzintensität beträgt etwa 128 Photonen/2 µs.}

_{Scanner: Galvanometer-Scanner, 2 µs/Pixel
Anregung: 488 nm Laser
Emission: 500–540 nm
Aktinfilamente (BODIPY FL) einer BPAE-Zelle}

Bei schwacher Fluoreszenz ergibt sich ein anderes Bild. Abbildung 15 zeigt dieselbe Probe mit schwacher Fluoreszenz – etwa 12 Photonen – aufgenommen mit den beiden Detektoren. Die mit dem SilVIR Detektor aufgenommenen Bilder weisen weniger Rauschen auf als die mit dem herkömmlichen GaAsP-PMT aufgenommenen Bilder. Zudem ist das Intensitätshistogramm des SilVIR-Bildes kammartig, was darauf hinweist, dass die Anzahl der Photonen in jedem Pixel genau erfasst wurde. Dem Intensitätshistogramm des GaAsP-PMT-Bildes zufolge ist die Bildintensität dagegen beliebig, was zu einem Mangel an Photonenquantifizierung führt. Zudem muss die Hochspannung entsprechend der Stärke der zu detektierenden Fluoreszenz beim GaAsP-PMT angepasst werden, nicht jedoch beim SilVIR Detektor.

_{Abbildung 15: Diese Abbildung zeigt eine Probe mit sehr schwacher Fluoreszenz, erfasst mit dem SilVIR Detektor (Abbildung 15a) und dem GaAsP-PMT bei 700 V (Abbildung 15b). Es wurde die gleiche Probe mit der gleichen Laserleistung angeregt. Die maximale Fluoreszenzintensität beträgt etwa 12 Photonen/2 µs. Das Intensitätshistogramm des mit dem SilVIR Detektor aufgenommenen Bildes weist eine kammartige Struktur auf, die darauf hinweist, dass die Anzahl Photonen genau erfasst wurde. Im Hintergrund des mit dem PMT aufgenommenen Bildes ist dagegen mehr Rauschen festzustellen.}

_{Scanner: Galvanometer-Scanner, 2 µs/Pixel
Anregung: 488 nm Laser
Emission: 500–540 nm
Mikrotubuli (Alexa Fluor 488) in einer PtK2-Zelle}

Bilder mit hohem Signal-Rausch-Abstand von Resonanzscannern mit SilVIR Detektor

Der SilVIR Detektor eignet sich gut zur Abbildung von Fluoreszenz von geringer Intensität. Insbesondere bei der Bilderfassung mit einem Resonanzscanner ist es schwierig, Bilder mit einem hohen Signal-Rausch-Abstand zu erfassen, da die Anzahl erfasster Photonen aufgrund der extrem kurzen Pixelverweilzeit sehr niedrig ist. Der SilVIR Detektor bietet eine Lösung für dieses Problem. Abbildung 16 ist ein mit einem Resonanzscanner aufgenommenes Bild mit 1024 × 1024 Pixeln. Es sind Bilder mit einer unterschiedlichen Anzahl von Mittelungen nebeneinander dargestellt. Selbst wenn die Anzahl detektierter Photonen auf dem Level einiger weniger Photonen liegt, lässt sich ein Resonanzscannerbild mit guter Bildqualität erhalten, und mit einer geringen Anzahl Mittelungen Akkumulationen (oder Akkumulationen) ist die Qualität des Resonanzscannerbilds mit der Qualität des Galvanometerscannerbilds vergleichbar. Dadurch erhöht sich auch die Effizienz der Bildaufnahme.

_{Abbildung 16: Mit dem SilVIR Detektor und einem 1K-Resonanzscanner aufgenommene Bilder. Abbildung 16(a) zeigt keine Mittelung bei 130 ms/Frame, Abbildung 16(b) zeigt eine zweifache Mittelung von 262 ms/Frame und Abbildung 16(c) eine vierfache Mittelung von 522 ms/Frame. Da der SilVIR Detektor bei Verwendung eines Resonanzscanners Bilder mit hohem Signal-Rausch-Abstand erfassen kann, reicht die geringfügige Mittelwertbildung zum Erhalt eines hochwertigen Bildes aus. Dadurch verbessert sich die Effizienz der Bildaufnahme.}

_{Resonanzscanner: 1024 × 1024 Pixel in eine Richtung, Pixelverweilzeit: 0,033 µs
Maximale Fluoreszenzintensität: etwa 20 Photonen.}

Effiziente Erfassung zusammengefügter Bilder mit dem SilVIR Detektor

Stitching wird häufig verwendet, um ein großflächiges, hochauflösendes Bild zu erhalten. Bei Verwendung eines Galvanometerscanners ist dieser Prozess langsam, wird aber durch Verwendung des SilVIR Detektors in Kombination mit einem Resonanzscanner wesentlich effizienter. In Abbildung 17 wurden die 4-Kanal-Bilder mit 1 K × 1 K Pixel in acht Z-Schnitten in einem 5 × 5 Mosaikfeld aufgenommen. Mit einem Galvanometerscanner dauerte die Aufnahme des Bildes mehr als 30 Minuten, mit einem Resonanzscanner waren es weniger als 6 Minuten.

_{Abbildung 17: Effiziente Bildaufnahme mit dem SilVIR Detektor. Mit einem Resonanzscanner wurde eine Projektion zusammengesetzter Z-Schnittbilder bei hoher Intensität erfasst. Aufgrund des hohen Signal-Rausch-Abstandes des SilVIR Detektors kann eine große Anzahl Bilder effizient erfasst werden.}

Aufnahme von Bildern mit hohem Dynamikbereich mit dem SilVIR Detektor

Bei der herkömmlichen PMT-Bildgebung ist der Dynamikbereich begrenzt. Das bedeutet, dass Prioritäten gesetzt werden müssen, wenn eine Probe sowohl dunkle als auch helle Objekte enthält. Beispielsweise war in Abbildung 18 bei der Aufnahme von Neuronen eine Intensitätssättigung am Zellkörper unvermeidlich, um klare Bilder der Struktur der Nervenfaser mit schwacher Fluoreszenz zu erhalten. Der SilVIR Detektor kann dank seines 16-Bit-Dynamikbereichs sowohl helle als auch dunkle Bereiche ohne Sättigung erfassen.

_{Abbildung 18: Bildgebung mit hohem Dynamikbereich mit dem SilVIR Detektor. Abbildung 18(a) zeigt ein herkömmliches Bild mit Sättigung einiger hellerer Zellkörper, während in Abbildung 18(b) ein mit dem SilVIR Detektor aufgenommenes Bild dargestellt ist, bei dem sich sowohl Zellkörper als auch Nervenfasern im Detektionsbereich befanden. Dunkle Nervenfasern wurden durch Anpassen der Gammaanzeige verstärkt.}

Mehrfarben-Bildgebung mit dem SilVIR Detektor

Aufgrund der hohen Empfindlichkeit und des hohen Signal-Rausch-Abstandes des SilVIR Detektors vom sichtbaren bis zum Nahinfrarot-Bereich ist eine gleichzeitige Bildgebung in sechs Farben möglich, während gleichzeitig die Auswirkungen von Übersprechen vermieden werden (Abbildung 16). Mit 730 nm angeregte Fluoreszenzfarbstoffe können mit einem GaAsP-PMT-Detektor kaum abgebildet werden, wohingegen der SilVIR Detektor Bilder mit hohem Signal-Rausch-Abstand aufnehmen kann. Das konfokale Mikroskop FV4000 kann mit einem Detektor für bis zu 6 Kanäle ausgestattet werden, der die gleichzeitige Abbildung von sechs Farben mit einer nanometergenauen spektralen Auflösung von 400 bis 900 nm ermöglicht.

_{Abbildung 19: 6-Farben-Darstellung, aufgenommen mit dem SilVIR Detektor und TruSpectral Technologie. Es ist ein simultanes Multicolor-Imaging vom sichtbaren bis zum Nahinfrarot-Bereich möglich.}
 

6. Zusammenfassung

Im Vergleich zu herkömmlichen Detektoren bietet der SilVIR Detektor zahlreiche Vorteile, zum Beispiel:

• Mehrfarben-Bildgebung mit hoher Empfindlichkeit und hohem Signal-Rausch-Abstand vom sichtbaren bis zum Nahinfrarot-Wellenlängenbereich.
• Hohe Auflösung bei der Photonendetektion (Photonenzählung mit hoher Geschwindigkeit und hohem Dynamikbereich).
• Hohe experimentelle Reproduzierbarkeit basierend auf der Quantifizierung der Bildhelligkeit ohne Empfindlichkeitseinbußen.
• Einfache Anwendung, da die bei einem PMT erforderliche Einstellung der Verstärkung entfällt.

Diese Vorteile ermöglichen den Erhalt von Bildern mit hoher Auflösung und hohem Signal-Rausch-Abstand in hoher Geschwindigkeit unter gleichzeitiger Reduzierung der Phototoxizität. Da die Bildhelligkeit außerdem als Anzahl der Photonen quantifiziert werden kann, sind der Datenaustausch und die Reproduktion der Aufnahmebedingungen deutlich einfacher.

Zudem besteht bei SiPM-Sensoren großes Potenzial für zukünftige technologische Entwicklungen. So könnte beispielsweise die FF, einer der Parameter, die die PDE bestimmen, erheblich verbessert werden, wenn sich das derzeit für zukünftige Sensoren mit Einzelphotonen-Avalanche-Dioden-Array (SPAD) und die Guard-Ring-Sharing-Technik entwickelte Mikrolinsen-Array [6], erfolgreich umsetzen lässt. Wenn die PDE erhöht werden kann, ist es einfacher, die komplexen Zusammenhänge zwischen Signal-Rausch-Abstand, Dynamikbereich, Geschwindigkeit und Pixelanzahl besser abzugleichen.

Wir sind davon überzeugt, dass der SilVIR Detektor zum Standard für die nächste Generation von Laser-Scanning-Mikroskopen werden kann, da er die mit herkömmlichen Detektoren verbundenen Herausforderungen löst und Potenzial für schnelle Weiterentwicklungen aufweist.
 

7. Literaturangabe

1. Hamamatsu Photonics „Photomultiplier Tubes: Basics and Applications 4th Edition“ (Hamamatsu Photonics, 2017).
2. Hamamatsu Photonics „MPPC®“ Kat.- Nr. KAPD9005E04 (Hamamatsu Photonics, 2022).
3. J. Zheng et al. „Dynamic-quenching of a single-photon avalanche photodetector using an adaptive resistive switch“ Nat. Communications 13, Artikelnummer 1517 (2022).
4. J. Friedrich, P. Zhou, L. Paninski „Fast online deconvolution of calcium imaging data“ PLoS Comput. Biol. 13(3): e1005423 (2017).
5. Evident corporation, US-Patent Nr. US11237047B2
6. K. Morimoto, E. Charbon „High fill-factor miniaturized SPAD arrays with a guard-ring-sharing technique“ Opt. Express 28(9/27), 13068–13080 (2020).
    

8. Erläuterungen technischer Begriffe

Externer photoelektrischer Effekt: Wenn ein Metall oder Halbleiter mit Licht bestrahlt wird, gelangen Elektronen im Metall oder Halbleiter aufgrund der Lichtenergie nach außen in das Vakuum.
Interner photoelektrischer Effekt: Ein Phänomen, bei dem durch die Bestrahlung eines Halbleiters oder Isolators mit Licht die Elektronenleitung im Inneren des Materials und die elektrische Leitfähigkeit zunimmt.
Geiger-Modus: Der Zustand einer Avalanche-Photodiode (APD), bei der durch eine angelegte Spannung eine Geiger-Entladung verursacht wird.
Durchbruchspannung: Wenn Spannung an eine APD angelegt wird, wird durch den Lichteinfall unabhängig von der Lichtmenge eine bestimmte, dem Lichtaufnahmeelement eigene Signalleistung erzeugt (Geiger-Entladung). Die Durchbruchspannung ist die kleinste angelegte Spannung, die dies verursacht.
Dunkelzählrauschen: Rauschen ohne Lichteinfall.
Übersprechrauschen: Gepulstes Rauschen, das durch den Übertritt von Photoelektronen aus benachbarten SiPM-Pixeln erzeugt wird.
Nachpulsrauschen: Pulsrauschen, das als Reaktion auf den ursprünglichen Photonen-Detektionspuls verzögert wird.
Detektion der Photonenzahl in einem paralysierbaren Modell: Einzelphotonenzählung, wenn ein Puls nicht getrennt werden kann und sich die Photonendetektionspulse kontinuierlich überlappen. Beispiel: Photonenzählung mit einer PMT.
Detektion der Photonenzahl in einem nicht-paralysierbaren Modell: Einzelphotonenzählung, bei der sich die Photonendetektionspulse überlappen, das Signal jedoch in Intervallen der Pulspaarauflösung ausgegeben wird. Dies entspricht der Verwendung eines SiPM als Detektor.
Puls-Paar-Auflösung: Minimales Zeitintervall, in dem Photonendetektionsspulse bei der Einzelphotonenzähldetektion getrennt werden können.

Autor

Hirokazu Kubo
Advanced Technology, R&D, Evident Corporation