Zuverlässige quantitative konfokale Fluoreszenzbildgebung mit der Mikroskop-Leistungsüberwachung

Einführung

Die Fluoreszenzbildgebung mittels optischer Mikroskopie kommt hauptsächlich bei qualitativen Untersuchungen zum Einsatz, immer häufiger aber auch bei quantitativen Analysen. In diesem Fall empfiehlt sich eine regelmäßige Wartung, da die Leistung der Lichtquelle beispielsweise durch Veränderungen der Umgebungstemperatur variieren kann, was die Bildqualität beeinträchtigt. Zudem kann die Laserleistung des Systems auch aufgrund einer leichten Fehlausrichtung der Optik von der Laserquelle zum Mikroskopstativ infolge der Wärmeausdehnung des Systems schwanken.

Konfokale Mikroskope sind komplexe Geräte, deren Wartung und Leistungsbeurteilung von einem geschulten Techniker durchgeführt werden müssen. Eine regelmäßige Wartung des Mikroskops ist wichtig für die Reproduzierbarkeit von Experimenten und die Qualität der Forschung. Dieses Thema ist nach wie vor aktuell und wird immer noch aktiv diskutiert.^1,2,3,4 Auch die International Organization for Standardization (ISO) hat sich damit befasst und die Norm ISO21073 2019 zur Bildleistung konfokaler Laser-Scanning-Mikroskope veröffentlicht.⁵

Evident hat die Bedeutung dieses Problems klar erkannt und entsprechend gehandelt. Daher verfügt das 2023 eingeführte konfokale Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW FV4000 über die Mikroskop-Leistungsüberwachung zur Leistungsüberwachung, mit dem Laborpersonal und Anwender drei wichtige Leistungsparameter überprüfen können, die die quantitative konfokale Fluoreszenzbildgebung beeinträchtigen und sich auf die Bildqualität auswirken können.

In diesem Whitepaper befassen wir uns näher mit diesen wichtigen Leistungsparametern und zeigen, wie die Mikroskop-Leistungsüberwachung zu einer qualitativ hochwertigen quantitativen Bildgebung beitragen kann. Zudem diskutieren wir die Grundsätze und Kriterien für die Messung der einzelnen Leistungsmerkmale sowie die Vorteile, die die Leistungsüberwachung bei der Optimierung der quantitativen Fluoreszenzbildgebung, beispielsweise in einem Zentrallabor, bietet.
 

Zu überwachende Leistungsfaktoren bei der quantitativen Fluoreszenzbildgebung

Im Jahr 2022 veröffentlichten O. Faklaris und Kollegen Empfehlungen zu sieben Leistungskennzahlen für Mikroskope, die regelmäßig überprüft werden sollten, sowie Richtlinien zur Messung dieser Kennzahlen.⁶ Die sieben Kriterien für die Mikroskopleistung sind: Stabilität der Bestrahlungsstärke, Abbildungsleistung, Ebenheit der Feldbeleuchtung, chromatische Aberration, Tischdrift, Wiederholbarkeit der Tischposition und Hintergrundrauschen des Detektors.

Allerdings ist es schwierig, diese Leistungsmerkmale ohne entsprechendes Fachwissen in der optischen Mikroskopie zu messen. Vor allem in einem Zentrallabor mit mehreren Mikroskopsystemen stellt dies ein Problem dar, da jeweils sichergestellt werden muss, dass alle diese sieben Faktoren innerhalb der Toleranzgrenzen bleiben.

In einem ersten Schritt hat Evident eine Lösung entwickelt, die es Anwendern ermöglicht, Fluoreszenzsignale auf einfache Weise quantitativ zu messen. Da sich Schwankungen des Fluoreszenzsignals anhand des eigentlichen Bildes nur schwer feststellen lassen, ist es unwahrscheinlich, dass der Anwender diese Probleme bemerkt. Anders ist es beispielsweise bei der chromatischen Aberration während Kolokalisierungsbeobachtungen oder der Tischdrift bei der Zeitrafferbildgebung, die leichter zu erkennen sind. Die Mikroskop-Leistungsüberwachung soll es Anwendern unter anderem ermöglichen, Leistungsschwankungen frühzeitig zu erkennen und nicht erst, nachdem sie ihr Bildgebungsexperiment abgeschlossen haben, was möglicherweise zu falschen Ergebnissen und zusätzlichem Aufwand führen kann.

Die Helligkeit eines Fluoreszenzmikroskops hängt stark von drei der oben genannten sieben Faktoren ab: der Stabilität der Bestrahlungsleistung, der Abbildungsleistung und der Detektionsempfindlichkeit.
Das liegt daran, dass die Fluoreszenzhelligkeit von der Intensität des auf die Probe eingestrahlten Lichts abhängt und davon, wie gut Fluoreszenzsignale detektiert werden können.

Bei einem Fluoreszenzmikroskop hängt die Intensität des auf die Probe gestrahlten Lichts von der Laserleistung und der bestrahlten Fläche ab. Der bestrahlte Bereich wird durch die Bildgebungsleistung bestimmt, d. h. davon, wie genau ein optisches Gerät den Lichtstrom von einer Lichtquelle auf einen einzigen Punkt fokussieren kann. Mit anderen Worten: Sowohl der Fokus des Laserstrahls sowie die Intensität des auf die Probe eingestrahlten Lichts variieren mit der Bildgebungsleistung.

Wie gut Fluoreszenzsignale erkannt werden können, hängt außerdem von der Detektionsempfindlichkeit des gesamten Systems ab. Daher ist es für eine einheitliche quantitative Fluoreszenzbildgebung hoher Qualität wichtig, die Veränderung der Laserleistung, der Bildgebungsleistung und der Detektionsempfindlichkeit zu überwachen.

Die Überwachung der Laserleistung ist wichtig, da die durch das Objektiv eingestrahlte Laserleistung aufgrund von Änderungen der Umgebungstemperatur oder anderer Faktoren schwanken kann. Beim FV400 wird die Laserleistung gemessen, unmittelbar nachdem der Laser vom Glasfaserausgang in das System gelangt. Dadurch kann das System feststellen, ob sich die Leistung seit der Installation des Mikroskops geändert hat. Durch die automatische Anpassung der Laserausgangsleistung kann das System Schwankungen ausgleichen und den Wert so im Laufe der Zeit konstant halten.

Die Detektionsempfindlichkeit muss überwacht werden, um einen Rückgang der Detektionseffizienz aufgrund einer Verschlechterung der Optik oder einer Fehlausrichtung der optischen Achse der Lochblende seit der Installation des Mikroskops quantitativ zu erfassen. Die Mittelposition der Lochblende ist bei konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen besonders wichtig und kann sich verschieben, zum Beispiel, wenn sich die Raumtemperatur jahreszeitlich bedingt stark verändert. Wenn sich das Mikroskop an einem Ort befindet, an dem die Temperatur sorgfältig reguliert wird und konstant bleibt, muss die Detektionsempfindlichkeit möglicherweise nicht überwacht werden. Allerdings sind nicht alle konfokalen Laser-Scanning-Mikroskope in einer derart hochstabilen Umgebung installiert. Zudem können, wenn auch selten, Staub und Kratzer auf der Linsenoberfläche die Lichtdurchlässigkeit verringern. Da diese Veränderung jedoch schrittweise erfolgt, ist der langsame Leistungsabfall mitunter schwer zu erkennen.

Schwankungen in der Bildgebungsleistung werden vor allem durch Kratzer auf der Oberfläche der Objektivlinse, Schmutz, die Verwendung des falschen Immersionsöls oder eine falsche Einstellung des Korrekturrings verursacht. Die meisten dieser Probleme mit der Bildleistung sind ohne fundierte Mikroskopie-Kenntnisse kaum zu erkennen. In einigen Fällen haben wir Leistungsprobleme festgestellt, die durch das Fallenlassen eines Objektivs verursacht wurden, was aber nie gemeldet worden war und daher unerkannt blieb.

Während die oben genannten Probleme mit der Bildgebungsleistung durch Probleme mit der Objektivlinse verursacht werden, sind andere Faktoren, wie z. B. die Fehlausrichtung von Spiegeln und Linsen zur optischen Achse aufgrund von Temperaturschwankungen, eine ebenfalls eine häufige Ursache für Leistungsprobleme.
 

So funktioniert die Mikroskop-Leistungsüberwachung

Die Mikroskop-Leistungsüberwachung misst unabhängig Laserleistung, Detektionsempfindlichkeit und Abbildungsleistung. Wie das System die einzelnen Merkmale misst, wird im Folgenden erläutert.

Laserleistung

Abbildung 1 enthält eine Übersicht über die Messung der Laserleistung mit der Mikroskop-Leistungsüberwachung. Sobald die Messung beginnt, führt das System automatisch den folgenden Ablauf aus.

1) Der 405-nm-Laser wird auf 100 % eingestellt, andere Laser werden auf 0 % eingestellt.

2) Der Laser wird abgestrahlt.

3) Der Laser wird teilweise von einem Strahlteiler (BS) reflektiert, der sich unmittelbar hinter dem Glasfasereingang des FV4000 befindet.

4) Der Lasereingang ist mit einem Fotodetektor (dem Laser Power Monitor bzw. LPM) im Inneren des FV4000 verbunden.

5) Das System berechnet die Laserleistung bei 100 % aus dem tatsächlichen LPM-Ausgabewert.

6) Der Laser wird auf 0 % eingestellt, dann wird der Kurzwellenlaser auf 100 % eingestellt.
Die Schritte 2–6 werden nacheinander für alle installierten Laser wiederholt.

_{Abbildung 1: Schematische Darstellung des Laserleistungsmesssystems.}

Die automatische Korrektur der Laserleistung erfolgt anhand des vom LPM gemessenen Wertes. Die gemessene Stromleistung wird mit der Leistung zum Zeitpunkt der Installation des Mikroskops verglichen, und es wird die prozentuale Differenz berechnet. Um die Laserleistung konstant zu halten, werden die Lasersteuerungsparameter auf Basis des berechneten Prozentwerts angepasst. Wir empfehlen Anwendern, diese Funktion zur Überwachung der Laserleistung vor jeder Bildaufnahme zu aktivieren, um sicherzustellen, dass die Laserleistung bei jedem Bildgebungsexperiment konstant bleibt.

Um festzustellen, inwieweit die von der Mikroskop-Leistungsüberwachung gemessene Laserleistung mit der tatsächlich auf die Probe abgestrahlten Lichtintensität übereinstimmt, haben wir die von der Mikroskop-Leistungsüberwachung gemessene Laserleistung und die vom Objektiv abgestrahlte Laserleistung über sechs Monate hinweg gemessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 gezeigt. Die vom Objektiv abgegebene Laserleistung wurde unter Verwendung eines UPLSAPO10X Objektivs gemessen.

Wie Abbildung 2 bestätigt, besteht eine hohe Korrelation zwischen der von der von der Mikroskop-Leistungsüberwachung gemessenen Laserleistung und der von der Objektivlinse abgegebenen Laserleistung, mit einer Genauigkeit innerhalb von 5 %. Wenn der Laser jedoch auf niedrig eingestellt war, ist die vom Objektiv abgegebene Laserleistung nicht stabil, wenn das Gerät nicht ausreichend vorgewärmt ist. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse während der Aufwärmphase des Systems über einen Zeitraum von zwei Stunden. Änderungen der vom Objektiv abgegebenen Laserleistung wurden bei sechs Laser-Sollwerten aufgezeichnet: 1 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % und 100 %. Aus Abbildung 3 geht hervor, dass der Vorwärmeffekt umso ausgeprägter ist, je niedriger die Lasereinstellung ist. Auf Grundlage dieser Daten empfehlen wir Anwendern, ihr System mindestens 60 Minuten lang vorzuwärmen und dann vor der Bildgebung die Anregungsleistung mit der Mikroskop-Leistungsüberwachung zu korrigieren.

_{Abbildung 2: Vergleich der vom Objektiv abgegebenen Laserleistung und der von der Mikroskop-Leistungsüberwachung gemessenen Laserleistung.}

_{Abbildung 3: Veränderung der vom Objektiv während des Vorwärmens abgegebenen Laserleistung bei unterschiedlichen Lasereinstellungswerten (1 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % und 100 %).}

Durch regelmäßiges Überwachen der Laserleistung lassen sich Leistungsabfälle des Lasers selbst sowie Defekte im Laserkombinierer und in der Glasfaser erkennen. Eine Wartung wird fällig, wenn die Ausgangsleistung unter 50 % der Ausgangsleistung fällt, die bei der Erstinstallation des Mikroskopsystems gemessen wurde. Wenn die Laserleistung diesen Schwellenwert erreicht, ist sie für einige Anwendungen, wie etwa die Tiefenbeobachtung, eventuell nicht mehr ausreichend, auch wenn die tatsächliche Ausgangsleistung stets so korrigiert wird, dass sie konsistent ist.

Werden die Laser mehrere Stunden lang ununterbrochen verwendet, kann sich die Wärmeentwicklung des Systems auf die Raumtemperatur auswirken und zu Schwankungen der Laserleistung führen. Aus diesem Grund empfehlen wir Anwendern, die Verwendungsdauer der Laser zu prüfen und die Laserleistung bei jeder Bildaufnahme zu korrigieren, da sie empfindlich auf Temperaturveränderungen reagiert.

Detektionsempfindlichkeit

Zur Ermittlung der Detektionsempfindlichkeit werden zwei Charakteristika gemessen: die Empfindlichkeit jedes einzelnen Detektors und die Position der Lochblende. Abbildung 4 zeigt eine Übersicht über das Messsystem für die Empfindlichkeit jedes Detektors, und Abbildung 5 zeigt ein Flussdiagramm der Reihenfolge der Erfassung der Aufnahmen entsprechend der Detektionsempfindlichkeit.  Sobald die Messung beginnt, führt das System, wie bei der Laserleistungsmessung, automatisch folgende Schritte durch.

Detektionsempfindlichkeit

1) Es wird der Strahlteiler BS10/90 ausgewählt, und der 405-nm-Laser und der Detektor 1 werden eingeschaltet (der Strahlengang wird automatisch so eingestellt, dass der Laser auf den ausgewählten Detektor reflektiert wird).

2) Der in den Spiegelrevolver des Mikroskoprahmens eingesetzte Eckwürfelspiegel reflektiert das Laserlicht und reduziert gleichzeitig die Laserleistung.

3) Das Laserlicht gelangt durch den Strahlteiler und die Lochblende zum Detektionssystem des FV4000.

4) Es wird die relative Empfindlichkeit des Detektors (Medianwert des Bildes) im Vergleich zur Empfindlichkeit desselben Detektors zum Zeitpunkt der Installation gemessen.

5) Der Detektor 1 wird ausgeschaltet, der Detektor 2 wird eingeschaltet, und die Schritte 2–4 werden wiederholt.

6) Dieser Vorgang wird für alle installierten Detektoren wiederholt.

Position der Lochblende

7) Es wird erneut Detektor 1 ausgewählt, und die Schritte 2–4 werden an jeder der 10 Positionen der optischen Achse der Lochblende (je 5 Positionen auf der X- und auf der Y-Achse, wobei die Lochblendenoberfläche die XY-Achse ist) 10-mal wiederholt.

_{Abbildung 4: Schematische Darstellung des Systems zur Messung der Detektionsempfindlichkeit.}

_{Abbildung 5: Flussdiagramm der Messung der Detektionsempfindlichkeit.}

Die Messung der Detektionsempfindlichkeit umfasst die Messung der Empfindlichkeitsschwankungen der einzelnen Detektoren und die richtige Position der optischen Achse der Lochblende. Eine Verringerung der Detektionsempfindlichkeit des Geräts insgesamt kann auf eine Fehlausrichtung der optischen Achsen der Lochblende zurückgeführt werden.

In Abbildung 6 oben links und oben in der Mitte sind Diagramme der Beziehung zwischen den 11 Positionen der optischen Achse der Lochblende und den entsprechenden Ausgangswerten des Erkennungssystems in X- und Y-Richtung dargestellt. Diese Diagramme zeigen auch Gaußsche Näherungskurven, die mit 5 der 11 Datenpunkte erstellt wurden. Mithilfe der Gaußschen Näherung kann der Betrag der Verschiebung mit hoher Genauigkeit berechnet werden, selbst wenn keine Daten über die Mittelposition der optischen Achse der Lochblende zur Verfügung stehen.

Die Verringerung der Fluoreszenzintensität aufgrund einer Fehlausrichtung der optischen Achse einer Lochblende hängt von der Vergrößerung und der numerischen Apertur (NA) der Objektivlinse ab. Die Lochblende wird konjugiert zur Brennebene des Objektivs positioniert, und die Größe des Beugungsscheibchens (Airy-Scheibchen) in der Lochblendenebene wird durch drei Faktoren bestimmt: Objektivvergrößerung, Projektionslinsenvergrößerung und Größe des Airy-Scheibchens in der Brennebene.

Das Diagramm oben rechts in Abbildung 6 zeigt die Beziehung zwischen dem Grad der Fehlausrichtung der optischen Achse der Lochblende und der Fluoreszenzintensität in der Zellprobe, wenn zwei Arten von Objektivlinsen verwendet werden. Der untere Teil von Abbildung 6 zeigt drei Beispiel-Fluoreszenzbilder, bei denen es sich um Zellbilder handelt, die mit einem UPLXAPO20X Objektiv aufgenommen wurden, wobei die optischen Achsen der Lochblende um -0,5 AU, 0 AU (Standard) bzw. +0,5 AU verschoben wurden. Das Diagramm oben rechts in Abbildung 6 basiert auf den Fluoreszenzintensitäten dieser Bilder sowie von Bildern, die bei jeder Verschiebung mit den Objektiven UPLXAPO20X (NA 0,8) und UPLSAPO100XS (NA 1,35) aufgenommen wurden.

Die Ergebnisse gelten für eine 1X-Vergrößerung des Projektionsobjektivs und zeigen, dass die Fluoreszenzintensität bei einer Verschiebung der optischen Achse der Lochblende um 0,32 AU (unter der Annahme einer Größe des Airy-Scheibchens von 1 für das Objektiv UPLXAPO20X) um 10 % für UPLXAPO20X und um 1,1 % für UPLSAPO100XS abnimmt. Dies verdeutlicht, dass eine Fehlausrichtung der optischen Achse der Lochblende je nach Objektiv unterschiedliche Auswirkungen hat.

_{Abbildung 6: Die gemessenen Werte der Fehlausrichtung der optischen Achse der Lochblende vs. Detektionsempfindlichkeit (oben links, oben Mitte). Fluoreszenzintensität der Objektive UPLXAPO20X und UPSAPO100XS vs. Fehlausrichtung der optischen Achse der Lochblende (oben rechts). Zellbilder, die mit einem UPLXAPO20X-Objektiv aufgenommen wurden, wobei die optische Achse der Lochblende um -0,5 AU, 0 AU bzw. +0,5 AU verschoben wurde (unten).}

Eine Wartung ist erforderlich, wenn die Empfindlichkeit der einzelnen Detektoren im Vergleich zu der bei der Erstinstallation des Systems gemessenen Empfindlichkeit auf weniger als 80 % sinkt. Das Kriterium für die Beurteilung der Position der Lochblende basiert auf der Verringerung der Fluoreszenzintensität bei Verwendung des UPLXAPO20X, da dieser die stärksten Auswirkungen zugeschrieben werden. Da es für Wissenschaftler schwierig ist, die Detektorempfindlichkeit und die Lochblendenposition selbst anzupassen, empfehlen wir Anwendern Evident zu kontaktieren, wenn die Ergebnisse weiterhin „Failed“ (Fehler) anzeigen.

Wir empfehlen, die Detektionsempfindlichkeit häufig zu messen, und insbesondere jedes Mal, wenn eine kritische quantitative Bildgebung durchgeführt werden soll, da sich die Detektionsempfindlichkeit bei Änderungen der Umgebungstemperatur und beim Vorwärmen des Systems leicht ändern kann.

Bildgebungsleistung

Abbildung 7 zeigt, wie die dreidimensionale Linienspreizfunktion (3D LSF) anhand dreidimensionaler Reflexionsbeobachtungen einer Kantenschablonen-Probe berechnet wird. Der Prozess umfasst die folgenden Schritte von der Messung des reflektierten Bildes bis zur quantitativen Bewertung der Abbildungsleistung.

1) Es wird die zu messende Objektivlinse ausgewählt.

2) Es wird eine Kantenschablonen-Probe auf den FV4000 Tisch gelegt.

3) Der 561-nm-Laser wird eingeschaltet, der Strahlteiler BS10/90 wird eingestellt und es wird ein Detektor aktiviert.

4) Die Lochblende wird auf 2 AU eingestellt, um dreidimensionale konfokale Reflexionsbilder der Kantenschablonen-Probe aufzunehmen.

5) Es werden die 3D-Kantensignale aus dem 3D-Bild, d. h. in acht Richtungen, extrahiert.

6) Die LSF wird durch Differenzieren des Kantensignals berechnet.

7) Es werden die 3D-LSF und die 2D-Kreuzkorrelationswerte der LSF mit idealer Bildgebungsleistung berechnet; die Korrelationswerte wurden mit der Zero-Mean-Normalized-Cross-Correlation (ZNCC) ermittelt ⁷.

_{Abbildung 7: Schematische Darstellung der 3D-LSF-Extraktionsmethode. 8 LSFs werden in XZ-Richtung extrahiert.}

Die Mikroskop-Leistungsüberwachung führt alle Aufgaben automatisch aus, mit Ausnahme derjenigen, die ein manuelles Eingreifen erfordern, wie etwa das Einstellen der Objektivlinse, das Fokussieren und das Zentrieren der Kantenschablone.

Zur Messung der 3D-LSF mit hoher Genauigkeit werden drei spezielle Ansätze verwendet. Erstens haben wir die Lochblende absichtlich auf 2 AU eingestellt, damit mehr reflektierte Lichtintensität erfasst werden kann, auch bei Defokussierung. Zweitens haben wir ein Exemplar mit nur acht hellen/dunklen Streifenpaaren im Vergleich zu einer typischen Sternkarte verwendet, was Interferenzen mit reflektiertem Licht von benachbarten Paaren beim Defokussieren verhindert. Drittens war die Kantenschablone extrem dünn, was es uns ermöglichte, Kantensignale nahe an den theoretischen Werten zu erhalten. Diese Ansätze führen zu genaueren und zuverlässigeren 3D-LSF-Messungen.

Die Punktspreizfunktion (PSF), die üblicherweise zur Bewertung der Abbildungsleistung verwendet wird, zeigt, wie ein einzelner Punkt auf dem Bild erscheint, und kann anisotrope Verschlechterungen der Bildgebungsleistung erfassen. Hingegen zeigt die LSF, wie Linien abgebildet werden, übersieht aber möglicherweise eine Verschlechterung der Bildgebungsleistung in bestimmten Richtungen.

Bei der oben beschriebenen Methode wird die 3D-LSF in acht Richtungen erfasst und liefert Informationen, die denen einer dreidimensionalen PSF (3D-PSF) nahezu gleichwertig sind. Abbildung 8 zeigt die simulierten Ergebnisse einer 3D-PSF und einer 2D-LSF in acht Richtungen bei Koma-Aberration, die auftritt, wenn das Objektiv und das Deckglas oder der Objekttisch relativ zum Objektiv gekippt werden.
Die 3D-PSF und die 2D-LSF verlaufen jeweils bananenförmig. In bestimmten Richtungen werden jedoch anisotrope Aberrationen, wie z. B. eine Koma-Aberration, von der 2D-LSF nicht erfasst, sodass die Analyse aberrationsfrei erscheint. Durch die Erfassung einer 2D-LSF in 8 Richtungen ist es möglich, anisotrope Informationen sowie eine 3D-PSF zu erfassen.

_{Abbildung 8: Vergleich der aus einer Simulation erhaltenen 3D-PSF und 3D-LSF.}

Um das äquivalente Level der LSF in 8 Richtungen und der PSF{quantitativ zu überprüfen, haben wir das Strehl-Verhältnis der PSF und die ZNCC der LSF berechnet, während der Betrag der Koma-Aberration und der sphärischen Aberration variiert wurde. Das Strehl-Verhältnis ist ein Wert, der die Lichtsammelintensität quantitativ angibt; es wird als Verhältnis der zentralen Intensität bei der PSF des tatsächlichen optischen Systems ausgedrückt, wenn die zentrale Intensität bei der idealen PSF, die mit einem aberrationsfreien optischen System erzielt wurde, 100 % beträgt. Das Strehl-Verhältnis korreliert bekanntermaßen stark mit der Wellenfrontaberration, einer Messgröße bei der Qualitätskontrolle von Objektiven.

Die Koma-Aberration ist eine der Aberrationen, die, wie bereits beschrieben, bei der Verwendung eines Mikroskops auftreten. Die sphärische Aberration wiederum ist eine weitere Aberration, die durch eine unzureichende Einstellung des Korrekturrings der Objektivlinse, die Verwendung des falschen Immersionsmediums oder das versehentliche Anhaften von Flüssigkeit am Objektiv oder an der Probenoberfläche verursacht werden kann. Die Grafik zeigt die Auswirkungen dieser Aberrationen. Die ZNCC-Werte sind Durchschnittswerte der Berechnungsergebnisse in 8 Richtungen. Zum Vergleich wird außerdem ein Diagramm angezeigt, das die Halbwertsbreite (FWHM) der PSF mit dem Strehl-Verhältnis vergleicht. Das Strehl-Verhältnis und die FWHM sind zwei quantitative Messgrößen der PSF.

Die Diagramme in Abbildung 9 zeigen, dass eine hohe Korrelation zwischen dem Strehl-Verhältnis der PSF und dem ZNCC der LSF besteht, mit einem hohen Determinationskoeffizient R2 von 0,959 in der linearen Regression. Daraus geht hervor, dass der ZNCC der 3D-LSF anstelle des Strehl-Verhältnisses der 3D-PSF verwendet werden kann. Andererseits gibt es zwar eine Korrelation zwischen FWHM und Strehl-Verhältnis, aber das deutet darauf hin, dass bei der Festlegung eines einheitlichen Schwellenwerts Vorsicht geboten ist. Beträgt die gemessene FWHM beispielsweise 340 nm, kann man davon ausgehen, dass die Abbildungsleistung unproblematisch ist, da sie nahe am theoretischen Wert von 320 nm liegt. Es könnte jedoch der Fall eintreten, dass das Strehl-Verhältnis aufgrund der sphärischen Aberration auf 65 % reduziert ist. Dennoch kann mit dem aus der 3D-LSF berechneten ZNCC die Bilderzeugungsleistung genauer bestimmt werden als mit der FWHM der PSF.

Für die direkte Messung des Strehl-Verhältnisses, einer weiteren Indexgröße, ist ein separates Gerät zur Messung der Wellenfrontaberration am Mikroskop erforderlich, für Anwender eine weitere Schwierigkeit darstellt. Stattdessen können Anwender den ZNCC verwenden, um die Bildgebungsleistung zu bestimmen.

_{Abbildung 9: Das Verhältnis zwischen dem aus dem 3D-PSF berechneten Strehl-Verhältnis und dem aus dem 3D-LSF berechneten ZNCC (oben) sowie dem aus dem 3D-PSF berechneten FWHM (unten).}

Der Auslöser für die Bildgebungsleistung erfordert eine Wartung, wenn sich das Strehl-Verhältnis auf unter 80 % verringert. Im Allgemeinen gelten 80 % des Strehl-Verhältnisses als Beugungsgrenze, d. h. ein Objektiv mit einem Strehl-Verhältnis unter 80 % hat eine unzureichende Leistung. Wir empfehlen Anwendern beim Starten des FV4000 Systems eine Überprüfung der Bildgebungsleistung durchzuführen. Diese Prüfung sollte am besten vor jedem neuen Anwender und nach 24-stündigem Gebrauch wiederholt werden.
 

Anwendungen der Mikroskop-Leistungsüberwachung

Abbildung 10 zeigt die Ergebnisse einer quantitativen Auswertung einer Kontrollprobe in einem Fluoreszenzquantifizierungsexperiment. Die Kontrollprobe ist je nach Experiment unterschiedlich, in diesem Beispiel wird sie jedoch als die Probe definiert, die zur Ausrichtung des Standards der Fluoreszenzintensität verwendet wird. Hier wurde das zweite Experiment einen Monat nach dem ersten durchgeführt. Das erste Experiment wurde durchgeführt, nachdem die Bedingungen für die Fluoreszenzbeobachtung festgelegt worden waren, und das zweite Experiment wurde unmittelbar nach dem Einschalten des Geräts durchgeführt.

Zur Verdeutlichung des Effekts wurden die Experimente unmittelbar nach dem Hochfahren durchgeführt, obwohl konfokale Laser-Mikroskope gemäß den Herstellerangaben eine Vorwärmphase benötigen. In dem Diagramm in Abbildung 10 wird die Fluoreszenzintensität der ersten und zweiten Kontrollprobe mit und ohne die Mikroskop-Leistungsüberwachung verglichen.

Es ist zu sehen, dass die Leistung unmittelbar nach dem Einschalten des Geräts instabil ist und die Daten stark schwanken, wenn keine Korrektur mit der Mikroskop-Leistungsüberwachung vorgenommen wird. Wurde hingegen eine Korrektur der Leistung durchgeführt, war eine Quantifizierung der Fluoreszenz mit hoher Genauigkeit möglich, selbst bei Experimenten, die über mehrere Tage hinweg durchgeführt wurden.

_{Abbildung 10: Die Schwankung der Fluoreszenzintensität von Kontrollproben während des zweitägigen Experiments.}
 

Zusammenfassung

Die Mikroskop-Leistungsüberwachung verfügt über halbautomatische Wartungsfunktionen für das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop FV4000. So wird die Effizienz der Wartungsarbeiten verbessert, und es ist keine Wartungsschulung für andere Anwender mehr erforderlich. Außerdem spart das System viel Zeit bei der Fehlersuche und liefert eindeutige Daten, sodass es einfacher ist, dem Hersteller genau mitzuteilen, was mit dem Mikroskopsystem nicht in Ordnung ist, wodurch Ausfallzeiten minimiert werden. Ein zusätzlicher Vorteil besteht darin, dass die von der Mikroskop-Leistungsüberwachung bereitgestellten Daten die Bedeutung des Vorwärmens der Geräte, der Einstellung des Korrekturrings des Objektivs und von Schwankungen der vom Objektiv abgegebenen Laserleistung dem Anwender gegenüber verdeutlichen können.

Bei Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopsystems bei wissenschaftlichen Experimenten kann die Vorabüberprüfung der Mikroskopleistung im Hinblick auf Fluoreszenzintensitätsschwankungen die Variabilität bei der Fluoreszenzquantifizierung erheblich verringern, was zu konsistenteren Bildern und quantitativeren Daten führt. Mit der halbautomatischen Messfunktion der Mikroskop-Leistungsüberwachung können selbst unerfahrene Mikroskopbenutzer diese Messungen problemlos selbst durchführen. Wenn die Versuchsergebnisse nicht wie erwartet sind, lässt sich außerdem feststellen, ob das Problem am Mikroskop oder an der Probe liegt.

Unserer Ansicht nach ist die Verbesserung nicht nur der Reproduzierbarkeit einzelner Experimente, sondern auch der Reproduzierbarkeit von Forschungsarbeiten in der Wissenschaft von entscheidender Bedeutung. Daher werden wir auch weiterhin daran arbeiten, die Rückverfolgbarkeit von Leistungsmessdaten von Mikroskopen zu verbessern.

*Dieser Inhalt basiert auf der technischen Entwicklung im RIKEN CBS-EVIDENT Open Collaboration Center (BOCC) und ist zum Patent angemeldet.
 

Autor

Yasuo Yonemaru
Advanced Technology, R&D, Evident Corporation

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