Der Modulationskontrast nach Hoffman, auch bekannt als Reliefkontrast, ist eine optische Mikroskopietechnik, die zum Verstärken des Kontrasts von ungefärbtem und lebendem Material in einem Kunststoffbehälter entwickelt wurde. Sie beruht auf der Erkennung optischer Gradienten und deren Umwandlung in unterschiedliche Lichtintensitäten.

Dieser Artikel befasst sich ausführlicher mit dem Modulationskontrast nach Hoffman, von der grundlegenden Mikroskopkonfiguration bis hin zu den Vorteilen und Einschränkungen.

Abbildung 1: Mikroskop-Basiskonfiguration für den Modulationskontrast nach Hoffman

Mikroskop-Basiskonfiguration für den Modulationskontrast nach Hoffman

Abbildung 1 zeigt die Mikroskop-Basiskonfiguration für den Modulationskontrast nach Hoffman. Ein optischer räumlicher Amplitudenfilter, von Hoffman als Modulator bezeichnet, wird in die hintere Brennebene eines Objektivs eingefügt. Die Intensität des Lichts, welches dieses System passiert, variiert über und unter einem Durchschnittswert, der dann moduliert wird. Geeignete Objektive für die Kontrastmodulation können den gesamten Vergrößerungsbereich von 10X, 20X und 40X abdecken.

Der Modulator hat drei Bereiche (dargestellt in Abbildung 2):

• Ein kleiner, dunkler Bereich nahe der hinteren Brennebene lässt nur 1 % des Lichts durch (Bereiche, die in Abbildung 2 mit D gekennzeichnet sind)
• Ein schmaler grauer Bereich lässt 15 % des Lichts durch (Bereiche, die in Abbildung 2 mit G gekennzeichnet sind)
• Der verbleibende klare bzw. transparente Bereich, der den größten Teil des Bereichs auf der Rückseite des Objektivs abdeckt, lässt 100 % des Lichts durch (Bereiche, die in Abbildung 2 mit B gekennzeichnet sind)

Anders als die Phasenplatte in der Phasenkontrastmikroskopie ist der Modulator so ausgelegt, dass er die Phase des Lichts, das die jeweiligen Bereiche passiert, nicht ändert. Mit einem Modulationskontrastobjektiv werden transparente Objekte, die in der gewöhnlichen Hellfeldmikroskopie im Wesentlichen unsichtbar sind, in 3D sichtbar, was durch Phasengradienten vorgegeben wird.

Beim Aufbau nach Hoffman befinden sich die Spalte in der vorderen Brennebene des Kondensors, wie in Abbildung 1 dargestellt. Wenn Licht durch den außeraxialen Spalt fällt, wird es auf die hintere Brennebene des Objektivs (auch Fourier-Ebene genannt) abgebildet, wo der Modulator installiert ist. Die vordere Brennebene des Kondensors mit der außeraxialen Spaltplatte ist optisch mit dem Modulator in der hinteren Brennebene des Objektivs verbunden. Die Bildintensität ist proportional zur ersten Ableitung der optischen Dichte in der Probe und unterliegt einem Phasengradientenbeugungsmuster nullter Ordnung.

Gegenüberliegende Gradienten führen zu einer Ablenkung des Spaltbildes in den sehr dunklen Bereich oder in den hellen Bereich des Modulators. In diesem Beispiel enthält eine hypothetische Probe positive und negative Phasengradienten (Dicke) und einen flachen Bereich (ohne Gradienten) und wird unter Verwendung optischer Modulationskontrastkomponenten abgebildet. Der positive Gradient lenkt Licht in den transparenten Bereich des Modulators, wo es nicht abgeschwächt wird und zu 100 % in die Zwischenbildebene gelangt. Entsprechend wird durch einen negativen Gradienten in den dunklen Bereich des Modulators gelenktes Licht auf etwa 1 % seines ursprünglichen Wertes abgeschwächt.

Alle Teile der Probe ohne Gradienten und der Hintergrund werden im grauen Bereich des Modulators registriert, wo etwa 15 % des Lichts in die Zwischenbildebene durchgelassen werden. Intensitätsbedingt ist daher der Bildbereich auf einer Seite des Gradienten dunkel. Die Intensität von der gegenüberliegenden Seite des Gradienten erzeugt einen hellen Bildbereich, und die Bereiche ohne Gradienten, ebenso wie der Hintergrund, erscheinen auf dem Bild grau.

4 Hauptvorteile des Modulationskontrasts nach Hoffman

Es gibt zahlreiche Vorteile und einige Einschränkungen des Modulationskontrasts nach Hoffman. Einige Vorteile des Modulationskontrasts nach Hoffman sind:

1. Bessere Nutzung der numerischen Apertur des Objektivs.

Die Möglichkeit, höhere numerische Aperturen mit dem Modulationskontrast nach Hoffman zu verwenden, ergibt eine hervorragende Detailauflösung mit gutem Probenkontrast und guter Sichtbarkeit.

2. Verwendung von Kunststoffbehältern.

Der Modulationskontrast nach Hoffman kann erfolgreich und ohne Bildverzerrung mit doppelbrechenden Materialien, wie z. B. Kunststoffbehältern, eingesetzt werden. Doppelbrechung ist das Phänomen, das bei bestimmten Materialien auftritt und bei dem ein einfallender Strahl (ein Lichtstrahl, der auf eine Oberfläche trifft) bei seinem Weg durch das Material in zwei Strahlen aufgeteilt wird.

Der Modulationskontrast nach Hoffman ist eine gute Alternative zu Kontrastverfahren, die mit doppelbrechenden Materialien nicht gut funktionieren. Zum Beispiel kann die Untersuchung doppelbrechender Materialien mit differenziellem Interferenzkontrast (DIC) zu Artefakten, Kontrastverlust und anderen Problemen mit der Bildqualität führen.

Daher ist der Modulationskontrast eine ideale Methode zur Beobachtung und Darstellung von Zell-, Gewebe- und Organkulturen in Kunststoffbehältern.

3. Durchführung von optischen Schnitten.

Auch ein „optisches Trennen“ ist mit dieser Technik möglich. Durch das Schneiden kann eine einzelne dünne Ebene der Probe fokussiert werden, ohne dass durch Bilder, die in Bereichen oberhalb oder unterhalb der fokussierten Ebene entstehen, Störungen entstehen.

Die Tiefe einer Probe wird in einer Richtung parallel zur optischen Achse des Mikroskops gemessen. Durch Fokussieren des Bildes wird der richtige Abstand zwischen Probe und Bild hergestellt, wodurch eine Interferenz der gebeugten Wellen auf einer vorbestimmten Ebene (der Bildebene) auftreten kann, die in einem festen Abstand vom Okular positioniert ist. So können beugende Elemente, die an unterschiedlichen Tiefen der Probe vorkommen, getrennt betrachtet werden, vorausgesetzt, es besteht ein ausreichender Kontrast.

Die gesamte Tiefe einer Probe kann optisch getrennt werden, indem sequenziell auf jede nachfolgende Ebene fokussiert wird. In diesem System ist die Schärfentiefe der Abstand von einer Ebene zur nächsten, in der jeweils die Darstellung eines bestimmten Details erfolgt, und durch die numerische Apertur des Objektivs vorgegeben. Objektive mit höherer numerischer Apertur weisen sehr geringe Schärfentiefen auf. Das Gegenteil gilt für Objektive mit kleinerer numerischer Apertur. Die Gesamtfähigkeit eines Objektivs, einen bestimmten optischen Ausschnitt zu isolieren und zu fokussieren, nimmt mit abnehmender optischer Homogenität der Probe ab.

4. Verbesserte Sichtbarkeit.

Ein weiterer Vorteil des Modulationskontrasts nach Hoffman ist die verbesserte Sichtbarkeit. Bilder erscheinen schattiert oder pseudo-dreidimensional, wodurch die Sichtbarkeit aufgrund von Kontrastunterschieden auf beiden Seiten eines Details verbessert wird. Anders als bei Bildern, die mit Phasenkontrastoptiken erzeugt wurden, liegt keine Lichthofbildung vor. Bei de Modulationskontrasttechnik nach Hoffman werden Phasengradienteninformationen in Amplitudendifferenzen umgewandelt, die sich stark von den von einem Phasenkontrastmikroskop erzeugten Phasenbeziehungsvariationen (und optischen Pfaddifferenzen) unterscheiden.

Mit den dunklen und grauen Bereichen im Modulator werden Bilder erzeugt, die unterschiedliche Grauschattierungen enthalten und farblos sind. Es ist möglich, Modulationskontrastbilder nachträglich zu färben, indem Modulatoren erzeugt werden, bei denen die grauen und dunklen Bereiche durch farbige Bereiche mit gleichen Transmissionswerten ersetzt sind. In diesem Fall würden die aus dem Phasengradienten resultierenden Bilder so wiedergegeben, dass Farben mit ähnlichen Gradienten den gleichen Farbton erhalten. Derzeit ist uns keine kommerzielle Quelle für Modulationsfilter bekannt, die farbige Bereiche enthalten.

Einschränkungen des Modulationskontrasts nach Hoffman

Es gibt auch mehrere Nachteile und Einschränkungen des Modulationskontrasts nach Hoffman. Erstens ist bei der Betrachtung solcher Bilder eine gewisse Vorsicht angebracht. Der Grund ist, dass verschiedene Beobachter eine Erhebung im Bild tatsächlich als Vertiefung sehen könnten oder umgekehrt, da das pseudo-dreidimensionale Bild durch das Okular betrachtet wird. Das System ist auch sehr empfindlich gegenüber Gradienten senkrecht zur Länge des Objektivs. Daher erfordert diese Technik ein gewisses Geschick, um die Probe so zu positionieren, dass der Effekt optimal ist.

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