In der modernen biowissenschaftlichen Forschung ist die Fluoreszenzmikroskopie eine beliebte und leistungsfähige Technik. Bei spezifisch durch Fluorophore markierten Zielstrukturen kann das emittierte Fluoreszenzsignal einen hervorragenden Abbildungskontrast mit minimalem Hintergrund bis hinunter auf die molekulare Ebene liefern.

Hochentwickelte optische Technologien sowie umfassende Markierungsansätze auf der Grundlage moderner Gentechnik sind die Erfolgsfaktoren der Fluoreszenzmikroskopie in der biologischen Forschung.

Doch trotz ihres generellen Erfolgs schränkt die Notwendigkeit fluoreszierender Marker oder Moleküle die Anwendungsmöglichkeiten der Fluoreszenzmikroskopie noch immer ein:

• Viele Biomoleküle fluoreszieren nicht, sind klein und werden leicht durch Fluoreszenzmarkierungen gestört
• Das Expressionsniveau und die Spezifität von Fluorophoren in lebenden Organismen erschweren mitunter die Interpretation experimenteller Ergebnisse
• Die Verwendung exogener Fluoreszenzmarkierungen wirft Bedenken hinsichtlich biomedizinischer Forschung am Menschen auf

Angesichts dieser Einschränkungen sind bei optischen Bildgebungsmethoden alternative Kontrastverfahren zur Fluoreszenz gefragt. In diesem Beitrag stellen wir alternative biologische Bildgebungsverfahren vor, um Ihnen zu helfen, über die Fluoreszenzmikroskopie hinaus zu denken und Ihre Forschungsmethoden zu erweitern.

Über die Fluoreszenzmikroskopie hinaus denken

Nichtlineare Optik kann Signale aus den intrinsischen Eigenschaften bestimmter Moleküle erfassen und so einen Abbildungskontrast ohne Fluoreszenz erzeugen.

Dank der Verfügbarkeit hochmoderner Laserquellen und Mikroskopietechniken ist die nichtlineare Optik nicht mehr nur für extravagante Experimente im Labor geeignet. Sie ist zu einer praktikablen Lösung für die biologische Bildgebung geworden und inspiriert Forscher, über die Fluoreszenzmikroskopie hinaus zu denken. Ein gutes Beispiel ist die „Optical Harmonic Generation (HG) Microscopy“, d. h. Mikroskopie unter Erzeugung optischer harmonischer Schwingungen.

SHG- und THG-Mikroskopie verstehen

Einfach ausgedrückt ist HG ein nichtlinearer optischer Prozess, bei dem n Photonen gleichzeitig mit dem Material wechselwirken und sich in ein Photon umwandeln. Die Second Harmonic Generation (SHG, zwei Photonen zu einem Photon) und die Third Harmonic Generation (THG, drei Photonen zu einem Photon) sind die meistverwendeten HG-Mikroskopieverfahren in der biologischen Bildgebung.

Der Prozess der Photonenumwandlung bei der SHG und THG ist im Jablonski-Diagramm (Abbildung 1) unten dargestellt: SHG liefert Photonen mit der doppelter Photonenenergie (der halben Wellenlänge), THG liefert Photonen mit dreifacher Photonenenergie (einem Drittel der Wellenlänge) der Anregungsphotonen.

Abbildung 1: Jablonski-Diagramm der optischen Prozesse SHG und THG. Gestrichelte Linien stellen virtuelle Zustände dar.

Wie die Multiphotonenmikroskopie erfordern SHG und THG eine ultraschnelle gepulste Laserquelle, typischerweise im nahen IR-Wellenlängenbereich, um nichtlineare optische Prozesse in einem kleinen Anregungs-Brennvolumen auszulösen. Infolgedessen bieten die SHG- und THG-Mikroskopie die folgenden Eigenschaften:

• Intrinsische optische Schnittfähigkeit
• Deep Imaging in stark streuendem Gewebe
• Geringes Photobleaching und geringe Phototoxizität
• Die SHG- und THG-Signalintensitäten sind proportional zur zweiten bzw. dritten Potenz der Laseranregungsleistung

Anders als bei der Multiphotonenmikroskopie werden jedoch die SHG- und THG-Signale von den optischen Eigenschaften und der Struktur des Materials bestimmt:

• Die SHG-Mikroskopie wird üblicherweise zur Abbildung von nicht-zentrosymmetrischen Molekülen und geordneten Strukturen wie Kollagenfasern, Mikrotubuli, Muskelmyosin, Stärke, Hautgewebe und Hornhautstroma eingesetzt.
• Die THG-Mikroskopie wird in der Regel zur Abbildung von Substanzen mit hohem Brechungsindex oder Grenzflächen (zu umgebendem Wasser) wie Zellorganellen, roten oder weißen Blutkörperchen, Lipidtröpfchen, Fettgewebe, Axon-Myelinhülle von Axonen und Knochen eingesetzt.

Da keine Fluorophore erforderlich sind, ermöglicht die SHG- und THG-Mikroskopie eine markierungsfreie Bildgebung und kann molekulare und strukturelle Informationen in biologischen Geweben, lebenden Organismen und, in der medizinischen Bildgebung, sogar für die Diagnose liefern.

Abbildung 2: SHG/THG-Bild von unmarkiertem Schweinefettgewebe, aufgenommen mit dem Multiphotonenmikroskop Olympus FVMPE-RS. Das SHG-Signal (Cyan) zeigt Kollagenfasern, und das THG-Signal (Magenta) zeigt Fett im Fettgewebe.

Nachdem wir nun die Grundlagen der SHG- und THG-Mikroskopie behandelt haben, finden Sie im nächsten Abschnitt einige Tipps, die Ihnen helfen sollen, diese Techniken in die Praxis umzusetzen.

Praktische Überlegungen zur Konfiguration der SHG- und THG-Mikroskopie

Da die SHG- und THG-Mikroskopie mit derselben NIR-gepulsten Laserquelle und derselben Laser-Scanning-Einheit wie die Multiphotonenmikroskopie durchgeführt werden können, lässt sich unser Multiphotonenmikroskop FVMPE-RS problemlos für die SHG- und THG-Mikroskopie einsetzen und so zu einem multimodalen Imaging-System machen.

Hier sind zwei praktische Überlegungen im Zusammenhang mit der Einrichtung der SHG- und THG-Mikroskopie:

1. Vorwärtsdetektion und hochempfindliche Detektoren:

   Während die Fluoreszenzemission im Allgemeinen isotrop ist, weisen SHG- und THG-Signale eine gewisse Richtungsabhängigkeit auf, die aus dem Wellenmischungsprozess resultiert. Bei den meisten Proben ist das Vorwärtssignal (vom Objektiv weg) viel stärker als das Rückwärtssignal (zum Objektiv hin). In diesem Fall sind ein Kondensor mit hoher NA und Non-Descanned-Detektoren (NDDs) mit Durchlichtbeleuchtung eine gute Wahl für die Detektion des Vorwärtssignals. In stark streuenden Geweben kann ein Teil des Vorwärtssignals zurückgestreut und durch Rückwärtssignaldetektion erfasst werden. Verwenden Sie in diesem Fall hochempfindliche NDDs wie z. B. eine Galliumarsenid-Phosphid-Photomultiplierröhre (GaAsP-PMT), um die Rückwärtsdetektionseffizienz zu optimieren, insbesondere wenn die Vorwärtssignaldetektion in Massenproben oder lebenden Tieren nicht anwendbar ist.

2. Gute Laserleistung bei einer längeren Wellenlänge:

   Das THG-Signal erfordert eine gute Laseranregungsleistung, um den nichtlinearen optischen Prozess auszulösen, und wird bei einem Drittel der Anregungswellenlänge erzeugt. Für eine bessere Signalübertragung und -detektion in der THG-Mikroskopie sollte eine Laserquelle mit guter Leistung bei einer Wellenlänge von mehr als 1200 nm verwendet werden, so dass das THG-Signal in den Bereich des sichtbaren Lichts fallen kann. Bisher waren ein NIR-gepulster Laser, ein optisch parametrischer Oszillator (OPO) und ein sachkundig geschulter Bediener erforderlich, um eine Laserquelle jenseits von 1200 nm zu erzeugen. Angesichts großer Fortschritte in der Lasertechnologie lassen sich heute mit einer Komplettlösung für einen ultraschnell gepulsten Laser, wie dem Spectra-Physics InSight^® X3, enorme Laserleistungen bei langer Wellenlänge erzeugen.

Erweitern Sie Ihre Forschungsmethoden über die Fluoreszenzmikroskopie hinaus

Unser Multiphotonen-Imaging-System FVMPE-RS, das mit modernster Mikroskopie- und Lasertechnologie ausgestattet ist, bietet die Möglichkeit, Multiphotonen-, SHG- und THG-Mikroskopie mit einer multimodalen Imaging-Plattform durchzuführen. Mit diesen leistungsstarken Funktionen können Sie Ihre Forschungsmethoden über die Fluoreszenzmikroskopie hinaus erweitern.

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