Im Jahr 2014 wurde der Nobelpreis für Chemie an drei Wissenschaftler „für die Entwicklung der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie“ verliehen. Infolgedessen hat die Mikroskopbranche in den letzten fünf Jahren eine dramatische Zunahme des Interesses an superauflösenden Mikroskopietechniken erfahren.
Zur Erläuterung des Begriffs: „Superauflösende Mikroskopie“ bezieht sich auf jede optische Technik, mit der sich Proben bei höherer Auflösung als der Beugungsgrenze konventioneller Lichtmikroskope betrachten lassen.
Im heutigen Blogartikel wird die superauflösende Mikroskopie eingehend behandelt. Erfahren Sie mehr über die Grenzen von Superauflösungsmikroskopen und entdecken Sie Möglichkeiten, Superauflösung mit Ihrem vorhandenen Mikroskopsystem nutzen.
Die Grenzen von Superauflösungsmikroskopen
Heute bietet fast jeder kommerzielle Hersteller von Mikroskopen superauflösende Geräte an. Diese Mikroskope sind fast so leicht zu bedienen wie ein normales Konfokalmikroskop, doch das war nicht immer so. Es dauerte Jahre, anwenderfreundliche Superauflösungsmikroskope zu entwickeln, die nicht von einem Fachmann bedient und ausgerichtet werden mussten.
Anfangs zeigte die Forschungsgemeinschaft großes Interesse an der Superauflösung. Dieses ließ jedoch nach, als den Forschern klar wurde, wie viel Aufwand diese Experimente erforderten. Die Ergebnisse lohnten nicht die Mühe, die Probenvorbereitung und die Abbildungsmedien zu verändern oder mühsame Schritte wie beispielsweise einen Brechungsindexabgleich durchzuführen.
ermöglichen konfokale Mikroskope eine superaufgelöste Bildverarbeitung?
Es ist erwiesen, dass eine Verkleinerung der Lochblendengröße auf unter 1 AE bei konfokalen Mikroskopen zu einer höheren Auflösung führt.
Theoretisch könnte auf diese Weise eine Auflösung erreicht werden, die zweimal höher ist als die üblicherweise als Superauflösung definierte Auflösung. In der Praxis hat sich jedoch gezeigt, dass die Auflösung nur um etwa das 1,4-Fache verbessert werden kann, da hochfrequente Signale im Vergleich zu den viel häufigeren niederfrequenten Signalen schwach sind.
Daher konzentrierten sich die Bemühungen darauf, bestehende Technologien wie die Konfokalmikroskopie zu verbessern, um hochfrequente räumliche Informationen, die bereits in konfokalmikroskopischen Bildern vorhanden sind, zu nutzen. Natürlich dachte man dabei an die Dekonvolution.
Wie funktioniert die Dekonvolution?
Durch Dekonvolutionsalgorithmen werden unscharfe Photonen auf Grundlage einer theoretischen oder bestimmten Punktspreizfunktion (PSF) wieder ihren ursprünglichen Positionen zugeordnet, um die Schärfe und den Kontrast der aufgenommenen Bilder zu erhöhen.
Tatsächlich lässt sich etwa bei einem Fluoreszenz-Bead mit einer Größe unterhalb der Auflösungsgrenze durch Dekonvolutionsalgorithmen allein die Halbwertsbreite (full width at half maximum, FWHM) so reduzieren, dass eine gemessene zweifache Erhöhung der Auflösung gegenüber einem Weitfeld-Fluoreszenzbild erreicht wird.
Gehen wir einen Schritt zurück und definieren wir Auflösung im Kontext der Mikroskopie. Traditionell wird sie mithilfe des Rayleigh-Kriteriums definiert. Dieses besagt, dass zwischen zwei Objekten eine Intensitätsabnahme um mindestens 26 % vorliegen muss, damit sie ordnungsgemäß als zwei getrennte Objekte erkannt werden können.
Besser bekannt ist dieses Prinzip unter der Bezeichnung Zwei-Punkt-Auflösung. Die Verkleinerung der FWHM eines nicht auflösbaren Objekts durch Dekonvolution liefert schärfere Bilder, doch das ist unter Umständen nicht ausreichend, um eine Superauflösung zu erzielen.
Es stellt sich also die Frage: Reicht die Dekonvolution aus, um tatsächlich superaufgelöste Daten von echten Proben zu erhalten?
Die Antwort lautet nein.
Eines der bekannteren linearen Dekonvolutionsverfahren ist der Wiener Filter. Der Wiener Filter behandelt alle Hochfrequenzdaten auf die gleiche Weise, was zu sogenannten Ringing-Artefakten führt, wie in der Abbildung unten dargestellt:
Man könnte argumentieren, dass diese Artefakte durch Veränderung der Filterstärke minimiert werden können oder dadurch, dass man die Wissenschaftler ganz außen vor lässt. Die Realität ist jedoch, dass große Artefakte bei der Beobachtung von Strukturen unterhalb der Auflösungsgrenze nicht akzeptabel sind.
Mit diesen Überlegungen im Hinterkopf haben wir Olympus Super Resolution entwickelt.
Erfassung (super-)klarer Bilder mit Olympus Super Resolution
Was genau ist Olympus Super Resolution (OSR)? OSR ist ein Filterverfahren, das bestimmte hochfrequente Rauminformationen verstärkt oder abschwächt, um ein zuverlässigeres Ergebnis zu liefern.
Dieser Prozess kann mit Dekonvolutionsalgorithmen gekoppelt werden, um superaufgelöste Bilder schärfer und kontrastreicher zu machen.
Wenden Sie sich noch heute an uns, um zu erfahren, wie Olympus Super Resolution Ihnen helfen kann, klare Bilder auf Ihrem Mikroskop zu erhalten.
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