Leitfaden zur Online-Mikroskopie: 6 Tipps für ein erfolgreiches Gelingen

Autor Takeo Ogama - 28 September, 2020

Immer mehr Labormitarbeiter arbeiten im Homeoffice, um die räumliche Distanzierung einzuhalten, und nutzen Online-IT-Plattformen, um zu kommunizieren und produktiv zu bleiben. Dieser Wandel in der Arbeitsweise von Wissenschaftlern und Laborpersonal bedeutet jedoch, dass Labore ihre Methoden bestmöglich auf Online-Plattformen umstellen müssen. Dieser Blogartikel enthält hilfreiche Tipps, wenn Sie nicht sicher sind, wie Sie das bewerkstelligen können.

Hier sind 6 hilfreiche Tipps für eine erfolgreiche Einführung der Online-Mikroskopie:

1. Festlegung von verfügbaren IT-Plattformen für das Labor.

Die Möglichkeiten zum Arbeiten über Remote-Verbindungen sind weitgehend von der IT-Infrastruktur des Labors abhängig.

Bei der Umstellung auf Online-Mikroskopie sollte zunächst festgestellt werden, welche Webkonferenz-Tools und -Software verwendet werden können und ob es im Institut Netzwerkbeschränkungen gibt. Darüber hinaus sind auch alle sonstigen vor Ort relevanten Aspekte im Zusammenhang mit IT-Infrastrukturen zu berücksichtigen.

Es muss sichergestellt werden, dass keine unerwarteten Unterbrechungen durch die Software auftreten. Beispielsweise könnten Windows Updates sich über Nacht installieren, einen Neustart erfordern und den Online-Betrieb beeinträchtigen. Zwar müssen geltende IT-Richtlinien befolgt werden, aber das Ausschalten von Updates kann helfen, dieses Problem zu vermeiden.

2. Festlegen der Mikroskopie-Arbeitsschritte unter Berücksichtigung dessen, was aktuell über Remote-Verbindungen möglich ist.

Der nächste Schritt ist die Planung und Aufteilung der Aufgaben für die Arbeit im Labor und für die Online-Mikroskopie im Homeoffice.

Dies kann von dem vorhandenen Mikroskop und der Untersuchung abhängen. Bei komplett motorgesteuerten Mikroskopen ist normalerweise nur die Einstellung der Objektive notwendig. Doch sollten dennoch die folgenden Hinweise als allgemeiner Leitfaden beachtet werden:

Im Labor durchzuführende Arbeitsschritte : Einstellung und Fokussierung der Probe, Einstellung des Korrekturrings, ggf. Auftragen von Öl und Einrichten einer Fernsteuerung
Per Remote-Verbindung durchführbare Arbeitsschritte: Betrieb nach Einstellung des Grob- und Feintriebs zur Betrachtung und Analyse oder Freigabe von Bildern

Selbst wenn das vorhandene System nicht für eine Online-Betrachtung oder Fernsteuerung ausgelegt ist, lohnt es sich, das Angebot der Anbieter zu prüfen.

Zum Beispiel sind die meisten professionellen Mikroskope modular aufgebaut und lassen sich zu einem motorgesteuerten System umrüsten. Außerdem gibt es heute viele Mikroskopie-spezifische Werkzeuge und allgemeine Webkonferenz-Plattformen zur Online-Betrachtung, Freigabe von Bildern oder Steuerung von Mikroskopen.

Allgemein eignet sich Öl nicht für die Online-Mikroskopie, da es schwierig sein kann, über eine Remote-Verbindung damit zu arbeiten. Es muss vor Ort aufgetragen werden und kann Probleme mit der Bildqualität verursachen und möglicherweise die Optik beschädigen, wenn zu viel aufgetragen wird oder nach der Verwendung keine gründliche Reinigung stattfindet. Eine Ausnahme ist jedoch die Verwendung einer Scannereinheit für die Forschung mit automatischer Ölabgabe. Bei entsprechender Erfahrung mit der Verwendung von Öl kann das Auftragen des Öls vor Beginn der Untersuchung in Betracht gezogen werden.

Abbildung 1: Allgemeine Richtlinien dazu, welche Arbeitsschritte bei der Online-Mikroskopie vor Ort durchzuführen sind. Es ist zu beachten, dass die Beleuchtungsbedingung je nach der Mikroskopkonfiguration aus der Ferne einstellbar ist.

3. Einstellung der Parfokalität.

Die Bedeutung der Parfokalitätseinstellung wird beim Blick durch das Okular oftmals unterschätzt, weil sich der Feintrieb nach dem Wechseln der Objektive so einfach und schnell einstellen lässt.Bei der Online-Mikroskopie jedoch wird Parfokalität zwischen verschiedenen Vergrößerungen zu einer kritischen Komponente für die Betrachtung.

Mit der perfekten Parfokalitätseinstellung muss der Fokus beim Wechseln der Vergrößerung nicht neu eingestellt werden. Mehr erfahren Sie in unserer Kurzanleitung zur Einstellung der Parfokalität mit einer Kamera. Wie hier bereits erwähnt, ist es wichtig, die Parfokalität durch die Okulare einzustellen, bevor die Parfokalität der Kamera eingestellt wird.

4. Überprüfung der Flachheit des Tisches.

Die Flachheit des Tisches lässt sich nicht aus der Ferne korrigieren und kann dazu führen, dass die Scharfeinstellung der Probe verloren geht. Glücklicherweise lässt sich die Flachheit des Tisches relativ einfach überprüfen. Bewegen Sie den Tisch einfach bei hoher Vergrößerung, die eine geringe Schärfentiefe aufweist (wird im Folgenden erklärt), in XY-Richtung, wenn Sie im Labor sind.

Wenn die Flachheit des Tisches nicht gegeben ist, könnte sich die Brennebene zur Z-Ebene der Probe verschieben, wodurch der Fokus auf die Probe während der XY-Bewegung verloren gehen kann. Während einige Tischeinlagen anderer Anbieter verstellbare Feststellschrauben aufweisen, sind die Einlagen von Olympus so ausgelegt, dass ein flacher Tisch ohne Justage vorliegt.

5. Einhaltung praktischer Fokussierverfahren für die Online-Mikroskopie.

Das Fokussieren zählt zu den Einstellungen, die aus der Ferne am schwierigsten vorzunehmen sind. Zudem lässt es sich nicht rückgängig machen, wenn das Objektiv mit der Probe kollidiert und die Probe oder die Optik beschädigt werden. Genauso wenig ist ein Eingreifen möglich, wenn die Probe von der Probenhalterung eines Inversmikroskops herunterfällt.

Wie also können solche Situationen vermieden werden? Befolgen Sie diese fünf allgemeinen Regeln für das Fokussieren aus der Ferne:

Sorgfältige Beobachtung: Das ist leichter gesagt als getan. Kritische Punkte sind die Bildfrequenz des Live-Bildes und die verzögerte Darstellung der tatsächlichen Z-Bewegung. Es gibt jedoch einige Verbesserungsmöglichkeiten. Zunächst ist das Binning oder Subsampling der Bildaufnahmeeinstellung eine allgemeine Methode zur Verbesserung der Bildfrequenz. Die Bildrate und Verzögerung können auch durch das verwendete Webkonferenz-Tool begrenzt werden. Einige Webkonferenz-Tools verfügen über ein Menü zur Einstellung der Bildqualität und Geschwindigkeit. Wir empfehlen, die Geschwindigkeit zu priorisieren, insbesondere bei der Suche nach der Brennebene.
Verwendung einer schrittweisen Methode mit einer höheren Schärfentiefe: Mit dieser Methode kann vermieden werden, dass jedes Bild außerhalb der Schärfentiefe liegt und Sie nichts sehen können. Bei einer extremen Unschärfe des Bildes ist es mitunter nicht möglich zu beurteilen, ob der Fokus höher oder niedriger eingestellt werden muss. Daher sollte vermieden werden, den Fokus auf das Ziel außerhalb der Schärfentiefe zu verlieren. Die Schärfentiefe wird mit der numerischen Apertur (NA) bestimmt. Ein Objektiv mit hoher NA hat eine geringe Schärfentiefe. Daher empfehlen wir die Einstellung des Fokus von einer geringen NA auf eine hohe NA, und in der Regel von einer geringen Vergrößerung auf eine hohe Vergrößerung. Auch bei Verwendung eines konfokalen Mikroskops kann das Prinzip der „höheren Schärfentiefe“ hilfreich sein. Da eine kleinere konfokale Apertur zu einer geringeren Schärfentiefe führt, verwenden Sie eine größere Apertur, um das Ziel zu identifizieren und zu fokussieren, wenn die Probe nicht zu sehen oder zu dunkel ist. Stellen Sie nach präziser Fokussierung die geeignete Konfokalität und Laserleistung für die Bildaufnahme ein.
Abbildung 2: Objektive mit geringer Vergrößerung haben häufig eine niedrige numerische Apertur und hohe Schärfentiefe, wodurch ein größerer Z-Bereich sichtbar wird (links). Objektive mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur haben eine geringe Schärfentiefe (rechts). Dies ist eventuell hilfreich, um nur die fokussierten Proben zu sehen, aber es besteht das Risiko, den Fokus zu verlieren.
Vorgehensweise aus der Ferne: Wie bereits erwähnt, könnte das Objektiv mit der Probe kollidieren. Dieses Worst-Case-Szenarium ist auf jeden Fall zu vermeiden, daher ist es wichtig, vorsichtig vorzugehen, wenn die Arbeit über eine Remote-Verbindung stattfindet. Bei einem inversen Mikroskop erfolgt die Annäherung von unten her. Bei einem aufrechten Mikroskop erfolgt die Annäherung von oben her. Wird die XY-Achse stark verändert, sollte zuerst das Objektiv und erst dann der Tisch bewegt werden.
Abbildung 3: Mit einem inversen Mikroskop (links) erfolgt die Annäherung an die Probe von unten und bei einem aufrechten Mikroskop (rechts) von oben.
Berücksichtigung der 3D-Form der Probe: Die Probe befindet sich an verschiedenen XY-Positionen möglicherweise nicht auf derselben Z-Ebene. Daher könnte bei einer zu großen Bewegung der Fokus auf die Probe verloren gehen. Dies könnte durch die Probe selbst oder, wie oben erwähnt, durch die Flachheit des Tisches bedingt sein. Bei der Verwendung eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur und geringer Schärfentiefe ist es besser, die XY-Position leicht zu verstellen und die Z-Achse vorsichtig zu justieren, d. h. die Position nicht zu sehr zu verändern, ohne gleichzeitig zu fokussieren. Bei Verlust des Fokus wechseln Sie, wenn möglich, zu einer höheren Schärfentiefe. Bei der Einstellung eines gekachelten Bildes kann die Fokuskarte bei der Einstellung der Fokushöhe helfen.
Abbildung 4: Wenn die Proben sich nicht auf derselben Z-Ebene befinden, kann der Fokus bei zu starker Veränderung der Position verloren gehen (a). In diesem Fall muss der Fokus neu justiert (b) oder ein anderes Objektiv ausprobiert werden.
Fokussierbegrenzung beachten: Zum Schutz der Probe und des Geräts könnte eine Fokussierbegrenzung verwendet worden sein. Die Fokussierbegrenzungsfunktion begrenzt den beweglichen Z-Bereich. Normalerweise muss die Fokussierbegrenzung nicht geändert werden. Wenn jedoch die Einstellung durch eine andere Person geändert wurde oder eine ungewöhnlich dicke Probe oder ein Gefäß mit dickem Boden verwendet wird, könnte die Fokussierbegrenzungsfunktion verhindern, dass das Objektiv nicht nah genug an die Probe herankommt. Die Einstellung der Fokussierbegrenzung kann nur im Labor erfolgen, da der faktische physikalische Abstand zwischen Objektiv und Probe beachtet werden muss.

Auch wenn hier einige Tipps zur Fokuseinstellung aus der Ferne gegeben wurden, empfiehlt sich alternativ eine Automatisierung der Fokussierung. Mehr über die automatische Fokussierung erfahren Sie in unserem Blogartikel: 4 Tipps für eine längere Lebendzell-Bildgebung mit weniger Zeit im Labor.

6. Verwendung einer Karte zur Bestimmung der XY-Position.

Eine weitere Herausforderung bei der Online-Mikroskopie ist es, den Überblick zu behalten. Dies ist durch die Kombination aus begrenzter Bildfrequenz, verzögerter Darstellung des Live-Bilds, begrenztem Sehfeld und den fehlenden direkten Blick auf den Mikroskoptisch bedingt.

Eine hilfreiche Lösung ist die Verwendung einer Karte. Mit einer Konfiguration des motorgesteuerten Tisches können Sie leicht eine Karte mit geringer Vergrößerung erstellen. Es lohnt sich, etwas mehr Zeit in die Erstellung einer Karte zu investieren, da damit sofort und kontinuierlich erkannt werden kann, welcher Bereich betrachtet wird. Und was noch wichtiger ist: Mit nur einem Klick gelangen Sie an jede gewünschte Position.

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