Konfokale Laserscanning-Mikroskope sind beliebte Tools in der biologischen Forschung. Sie können mehrere Fluorophore gleichzeitig mit guter Farbtrennung abbilden und Strukturen tief im Innern einer biologischen Probe mit erweiterten Schnittdarstellungsmöglichkeiten darstellen.
Nun sind mit den neuesten Innovationen in der Lasertechnik noch ausgefeiltere Darstellungen möglich. In diesem Blogartikel befassen wir uns damit, wie die neuen Nahinfrarotlicht(NIR)-Anregungslaser zusammen mit unseren FV4000 Konfokalmikroskopen erweiterte Multiplexing-Anwendungen möglich machen.*
Multiplexing mit 5 oder mehr Kanälen in der konfokalen Mikroskopie – Überwindung technischer Herausforderungen mit dem FV4000 System
Werfen wir zunächst einen Blick auf die Geschichte der Multiplexing-Darstellung.
Jahrelang wurden Immunfluoreszenzuntersuchungen meist mit DAPI und zwei anderen Farben durchgeführt, in der Regel im grünen und roten Bereich des Spektrums.
Durch die Weiterentwicklung der Antikörper einerseits und der Imaging-Systeme andererseits mit mehr Detektoren und besseren Wellenlängenfiltern wurde die Vierfarben-Immunfluoreszenz populär. Die häufigste Vier-Farben-Kombination war die Kombination von DAPI, grün, rot und fernrot in einem Bild.
Zwei kritische Faktoren verhinderten bislang jedoch die Nutzung eines fünften oder sechsten Kanals für das Multiplexing:
1. Die Nichtverfügbarkeit von NIR-Laserdioden mit guten Strahlqualitäten
Erstens waren NIR-Laserdioden mit guten Strahlqualitäten für konfokale Laserscanning-Mikroskope nicht allgemein verfügbar. Für die Anwendung in der konfokalen Bildgebung müssen Laserdioden über eine ausreichende (aber nicht zu hohe) Leistung verfügen und sehr geringe Leistungsschwankungen sowie kompatible Strahlprofile aufweisen. Bis vor kurzem gab es jedoch nur wenige NIR-Laserdioden in diesen Wellenlängenbereichen.
Die neueste Laserdiodentechnologie hat diesbezüglich jedoch viel verändert. Unser FV4000 Konfokalmikroskop bietet jetzt 685 nm, 730 nm und 785 nm Laserdioden für die effiziente Anregung von Sekundärfarbstoffen, die u. a. in der folgenden Tabelle aufgeführt sind.
| Laser | Fluoreszenzfarbstoff | λ_Ex (nm) | λ_Em (nm) |
|---|---|---|---|
| LD685 | Alexa Fluor 680 | 679 | 702 |
| DyLight 680 | 692 | 712 | |
| Alexa Fluor 700 | 696 | 719 | |
| iRFP720 | 702 | 720 | |
| LD730 | ATTO 740 | 743 | 763 |
| DiR | 750 | 782 | |
| Alexa Fluor 750 | 752 | 779 | |
| Cy7 | 753 | 775 | |
| DyLight 755 | 754 | 776 | |
| LD785 | DyLight 800 | 777 | 794 |
| IR-Farbstoff 800CW | 778 | 794 | |
| Alexa Fluor 790 | 782 | 805 | |
| Cy7.5 | 790 | 810 |
Diese Farbstoffe, zusammen mit einer wachsenden Anzahl neuer Fluorophore, machen das Hinzufügen eines fünften und sechsten simultanen Kanals für das Multiplexing attraktiver.
2. Photomultiplier-Röhren mit reduzierter Empfindlichkeit im NIR-Wellenlängenbereich
Die zweite Schwierigkeit beim Erreichen einer effizienten NIR-Bildgebung bestand darin, dass viele Photomultiplier-Röhren (PMTs), die als Standarddetektoren für konfokale Laser-Scanning-Mikroskope verwendet werden, bei den für den NIR-Wellenlängenbereich typischen Detektionswellenlängen (über 750 nm) eine geringere Empfindlichkeit aufweisen.
Diese reduzierte Empfindlichkeit in den Nahinfrarotlicht-Detektionsbereichen betrifft vor allem populäre GaAsP-PMT, die dafür aber eine höhere Empfindlichkeit im mittleren sichtbaren Spektrum bieten. Im Bereich ab 750 nm haben GaAsP-Detektoren eine sehr geringe Empfindlichkeit.
Zur Lösung dieses Problems haben wir die SilVIR Detektionstechnologie in unser konfokales Lasermikroskop FV4000 integriert. Unser SilVIR Detektor verwendet einen Silizium-Photomultiplier (SiPM), einen Halbleitersensor, der die Erfassung von Fluoreszenzbildern mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis über einen breiten Wellenlängenbereich von 400 nm bis 900 nm ermöglicht.
Somit verfügt unser FV4000 System über einen SilVIR Detektor mit bis zu 6 Kanälen für Multiplexing-Anwendungen. In Kombination mit unseren X Line Hochleistungsobjektiven bietet das FLUOVIEW FV4000 System eine effektive und breite Korrektur der chromatischen Aberration zwischen 400 und 1000 nm. Die Kombination aus SilVIR Detektoren und X Line Objektiven führt zu einer wesentlich höheren Zuverlässigkeit bei der Multiplex-Fluoreszenz-Bildgebung und der NIR-Bildgebung insgesamt.
*Bei diesem Artikel handelt es sich um eine aktualisierte Fassung des am 21. Januar 2020 veröffentlichten Originalinhalts.
