Das Hospital Nacional de Parapléjicos (HNP) in Toledo, Spanien, ist ein nationales Referenzzentrum für Rückenmarkverletzungen in Spanien. Das HNP bietet umfassende Gesundheits- und Rehabilitationsdienste für Menschen mit Rückenmarkverletzungen, fungiert als Ausbildungszentrum und führt wissenschaftliche Forschung im Bereich der Neurowissenschaften durch.
Zur Unterstützung der neurowissenschaftlichen Forschung besitzt das HNP zentrale Einrichtungen für Mikroskopie und Bildanalyse, Durchflusszytometrie, Proteomik, sowie Kernspinresonanz (NMR) für Kleintiere und Tierhaltung. Teil der Einrichtung für Mikroskopie und Bildanalyse ist eine leistungsstarke multimodale Lösung zum Scannen ganzer Objektträger und zum High-Content-Screening (HCS) mit einem einzigen Mikroskop.
Diese Lösung ist eine Kombination des automatisierten Mikroskopsystems IXplore Pro mit der High-Content-Screening-Software scanR und der cellSens Bildgebungssoftware. Sie kann an eine Vielzahl von Anwendungen und Bildgebungsverfahren angepasst werden, beispielsweise zur erweiterten Bildanalyse mit TruAI Deep-Learning-Technologie.
Abbildung 1: Übersichtsaufnahme des Hospital Nacional de Parapléjicos in Toledo, Spanien, Foto mit freundlicher Genehmigung von Juan Carlos Monroy.
Die Einrichtung für Mikroskopie und Bildanalyse am Hospital Nacional de Parapléjicos wird von Dr. José Ángel Rodríguez Alfaro und Dr. Javier Mazarío geleitet. Wir haben uns kürzlich mit ihnen unterhalten, um mehr über ihre Erfahrungen mit dem IXplore Pro System mit der scanR und cellSens Software in den zentralen Diensten der Einrichtung zu erfahren.
F: Warum haben Sie ein IXplore-Mikroskopsystem mit scanR Software für Ihre Einrichtung in Betracht gezogen?
A: In unserer Einrichtung verfügen wir über eine Vielzahl optischer Mikroskope, von automatisierten Laser-Scanning-Konfokalmikroskopen bis zu manuellen Routinemikroskopen. Wir hatten zuvor ein geschlossenes System für die High-Content-Analyse (HCA), das nach 10 Jahren Betrieb ausfiel, und brauchten einen Ersatz.
Dabei suchten wir nach Möglichkeiten, die mit diesem System gewonnenen Daten in eine Durchflusszytometrie-Analysesoftware zu exportieren, um eine verfeinerte Analyse der mit unserem HCA-System gewonnenen Messungen unter Anwendung bestimmter Gates durchzuführen.
Uns gefiel an dem scanR System vor allem, dass die zytometrische Analyse mit Anwendung von Gates bereits in die Software integriert war. Wir haben kein anderes HCA-System gefunden, das solche Analysen durchführen kann. Dies war einer der Hauptgründe, die uns zu einem IXplore System mit scanR Software bewogen haben.
F: Welche anderen Funktionen des Systems haben Ihnen gefallen?
A: Uns gefiel, dass es sich nicht um ein geschlossenes System handelte und wir mit der cellSens Software und einem Weitwinkelmikroskop auch Objektträger scannen können. Durch diese Zwei-in-Eins-Konfiguration eignete sich das System perfekt für uns, da wir so die Vielfalt der von unserer Einrichtung angebotenen Dienstleistungen erweitern konnten.
Der modulare Aufbau des Systems ist sehr praktisch. Dadurch können wir bei Bedarf weitere Funktionen ergänzen, z. B. einen Inkubator für Lebendzellstudien.
Ein weiterer wichtiger Punkt war die Möglichkeit, eine hochmoderne Bildanalysetechnologie mit künstlicher Intelligenz wie TruAI in unser Portfolio aufzunehmen, die nicht nur mit cellSens und scanR Bildern funktioniert, sondern auch mit Bildern, die mit anderen Mikroskopsystemen aufgenommen wurden.
F: Welche Auswirkungen hatte die Einführung eines IXplore Systems in Ihrer Einrichtung? Was hat sich geändert?
A: Das IXplore System in Kombination mit der scanR Software hat sich schnell zum meistgenutzten Mikroskop unserer Einrichtung entwickelt. Die Nutzungszeit ist mehr als doppelt so hoch wie bei den konfokalen Mikroskopen, den bisherigen „Stars“ der Einrichtung.
Obwohl es sich um ein Epifluoreszenzmikroskop handelt, ist die Auflösung der Bilder so gut, dass die Forscher für einige Studien einen Wechsel von der konfokalen Bildgebung in Erwägung ziehen, insbesondere angesichts der hohen Geschwindigkeit des Systems, nicht so sehr wegen der Z-Auflösung. Damit lassen sich Bilder erfassen, deren Aufnahme mit unseren Laser-Scanning-Konfokalmikroskopen zu zeitaufwändig wäre.
Dabei geht es nicht nur um eine höhere Geschwindigkeit, sondern auch um die Möglichkeit, den 4er-Schlitten für Objektträger zusammen mit der Fokuskarte für Experimente zu nutzen, die über Nacht unbeaufsichtigt aufgenommen werden.
Die Möglichkeit, die Daten während der Erfassung mit der scanR Software zu analysieren, ist eine weitere große Verbesserung gegenüber unserem früheren HCA-System. Sobald die Bilderfassung abgeschlossen ist, erhalten wir die Analyseergebnisse und können mit der nächsten Probe fortfahren.
Die TruAI Deep-Learning-Technologie hat sich ebenfalls als sehr nützliches Werkzeug erwiesen. Die Erkennung von Zellkernen in Zellkulturproben mit hoher Dichte hat sich gegenüber Standard-Segmentierungstechniken drastisch verbessert, so dass präzisere Daten aus Experimenten gewonnen werden können.
F: Können Sie ein Beispiel aus Ihrer Einrichtung nennen, in dem das IXplore System mit der cellSens Software verwendet wird? Was wollen die Forscher auf den Bildern sehen?
A: Sehr oft nehmen wir hochauflösende Bilder von Quer- oder Horizontalschnitten des Rückenmarks von Mäusen, Ratten oder sogar Schweinen auf, wo wir nach Veränderungen der Gliazellpopulationen, des Überlebens von Neuronen oder der Expression verschiedener Marker nach einer Rückenmarkverletzung sowie nach Axonen suchen, die über die Verletzungsstelle wachsen.
Aber wir sind nicht auf das Rückenmarkgewebe beschränkt. Wir führen auch hochauflösende Scans von Hirnschnitten durch. In diesem Beispiel wurde ein ganzer Abschnitt eines Mäusegehirns mit Hilfe des differentiellen Interferenzkontrasts (DIC) gescannt, um den Ort der Expression des fluoreszierenden Reportergens mCherry zu bestimmen.
Abbildung 2: Vollbild eines Mäusegehirns auf dem Objektträger mit DIC und Fluoreszenz. Bild mit freundlicher Genehmigung der Experimental Neurophysiology and Neural Circuits Group am HNP. 14
Abbildung 3: Nahaufnahme einer Region aus dem vorherigen Bild. Bild mit freundlicher Genehmigung der Experimental Neurophysiology and Neural Circuits Group am HNP. 18
F: Können Sie ein Beispiel aus Ihrer Einrichtung nennen, bei dem die scanR Software für HCA verwendet wird? Was wollen die Forscher in den Daten sehen?
A: HCA wird sehr häufig für Studien zur Zellproliferation, -differenzierung und -migration unter verschiedenen Bedingungen verwendet. In unserer Einrichtung ist einer der häufigsten Assays, den wir mit der scanR Software durchführen, der Nachweis der Expression von Reportergenen (GFP und mCherry) bei verschiedenen Behandlungen. Wir kombinieren den Einsatz von TruAI für die Segmentierung von Zellkernen in hochdichten Zellkulturen mit einer Analyse unter Anwendung von Gates, um die Anzahl der einfach und doppelt markierten Zellen in der Population zu quantifizieren und die verschiedenen Behandlungen zu bewerten.
Wir haben das System auch zum Nachweis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) in Blut- und Spermaproben eingesetzt. In diesem Fall verwenden wir TruAI nicht nur zur Segmentierung der Zellkerne, sondern auch zur Erkennung von FISH-Spots innerhalb der Zellkerne.
Abbildung 4: Das Hauptfenster der scanR Software zeigt die Segmentierung von Zellen und Kernen, umgeben von Streudiagrammen und Histogrammen. In den zweidimensionalen Streudiagrammen stellt jeder Punkt eine segmentierte Zelle dar. In den eindimensionalen Histogrammen stellt jede Linie einen Parameterwert dar, wobei die Höhe der Linie der Anzahl der Zellen mit diesem Wert entspricht. Im ersten Scatterplot wählt ein Gate (R01) eine Teilpopulation von Zellen nach Größe und Form aus und wird in die folgenden Analyseplots übertragen. Zellen außerhalb von R01 werden aussortiert. Im zweiten und dritten Analyseplot werden Gates mit positiven grünen Zellen (R02) und positiven roten Zellen (R03) erstellt. In der abschließenden Analysezeichnung werden R01, R02 und R03 kombiniert, um den Anteil der einfach und doppelt positiven Zellen zu ermitteln. Die Daten wurden mit freundlicher Genehmigung der Molecular Neurology Group des HNP zur Verfügung gestellt. 22
Abbildung 5: Mit der scanR Software können Sie Galerien aus den Gate-Regionen erstellen. Die Beispiele zeigen Galerien für die Zellpopulationen: doppelt negativ, einfach positiv grün, einfach positiv rot und doppelt positiv grün-rot. Die Ergebnisse können in Tabellen exportiert oder als Heatmap im Kontext einer Wellplatte visualisiert werden. Die Daten wurden mit freundlicher Genehmigung der Molecular Neurology Group des HNP zur Verfügung gestellt.
F: Verwenden Sie die TruAI Technologie, um eigene Deep-Learning-Modelle für neuronale Netze zu entwickeln?
A: Ja. Wir haben Modelle zur Segmentierung von Kernen dicht gepackter Zellen, zur Erkennung von Neuronen in Rückenmarkschnitten, zur Klassifizierung verschiedener Muskelfaserarten, zur Erkennung anormaler Kerne nach bestimmten Behandlungen usw. trainiert.
Eine der Funktionen, die wir an der Software am meisten schätzen, ist die Möglichkeit, neuronale Netzwerkmodelle zu trainieren, und zwar nicht nur anhand von Bildern, die mit diesem System aufgenommen wurden, sondern auch mit Bildern, die mit anderen Mikroskopen als Olympus-Mikroskopen aufgenommen wurden. Da wir jetzt mit OlyVIA, einer kostenlosen Visualisierungs-App, Bilder mit Anmerkungen versehen können, wird die Arbeit noch bequemer, da die Nutzer an ihrem eigenen Computer im Büro oder sogar zu Hause arbeiten können.
Abbildung 6: Das linke Bild zeigt den neuronalen Marker NeuN (grün) in einem Schnitt durch das Rückenmark einer Maus. Das rechte Bild zeigt denselben Schnitt mit einer Schicht, in der die TruAI-Detektion von NeuN-positiven Zellen (rosa) zu erkennen ist. Bilder mit freundlicher Genehmigung der Molecular Neuroprotection Group am HNP. 28
F: Was gefällt Ihnen am besten an diesem System?
A: Wie bereits erwähnt, gibt es viele Dinge, die wir an diesem System schätzen. Am bemerkenswertesten ist vielleicht, dass wir dank der Kombination mit der cellSens und der scanR Software mit nur einem Mikroskopsystem ganze Objektträger für HCA einscannen können. Diese Zwei-in-Eins-Konfiguration ist zur Optimierung der Ressourcen in unserer Einrichtung absolut sinnvoll. Natürlich auch TruAI, das mit beiden Systemen vollständig kompatibel ist. Dadurch können wir Modelle neuronaler Netze in beiden Programmen verwenden, unabhängig davon, welches Programm für das Training genutzt wurde.
Erfahren Sie mehr über die IXplore Mikroskopsysteme
Die IXplore Mikroskopserie umfasst inverse Mikroskope speziell für verschiedene Anwendungen in der biowissenschaftlichen Forschung. Die motorgesteuerten inversen IXplore Pro Mikroskope bieten Hellfeld-, Mehrkanal-Fluoreszenz-, Z-Stapel- und Stitching-Funktionen.
Das IXplore System wird mit der cellSens Software gesteuert, der Plattform für kamerabasierte Mikroskope von Olympus, die sich an eine Vielzahl von Anwendungen und Bildgebungsverfahren in der Weitfeldmikroskopie anpassen lässt. Dazu gehören die Routinemikroskopie, die konfokale Spinning-Disk-Mikroskopie, hochauflösende Mikroskopie, Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF), Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) und viele mehr.
Mit ausgewählter Hardware kann dasselbe IXplore Mikroskop auch mit der scanR Software gesteuert werden, die speziell für High-Content-Screening-Anwendungen in Well-Platten und Kammer-Objektträgern optimiert ist.
Die befragten Personen
Vielen Dank an Dr. José Ángel Rodríguez Alfaro und Dr. Javier Mazarío, Leiter der Haupteinrichtung für Mikroskopie und Bildanalyse am Hospital Nacional de Parapléjicos, Spanien, für die Weitergabe ihrer Erfahrungen in diesem Interview. Wenn Sie Fragen an die Einrichtung haben, senden Sie eine E-Mail an microscopia.hnp@sescam.jccm.es.
Dr. José Ángel Rodríguez Alfaro und Dr. Javier Mazarío, Leiter der Haupteinrichtung für Mikroskopie und Bildanalyse am Hospital Nacional de Parapléjicos, Spanien.
*Das scanR System ist in Japan nicht erhältlich.
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