Dr. Masayasu Takis Forschungsbereich ist die Untersuchung biologischer Phänomene, die bisher nicht sichtbar gemacht werden konnten. Dazu entwickelt er Sonden, die auf neuen Fluoreszenzfarbstoffen und Nahinfrarot-Fluoreszenz (NIR) basieren. In diesem Interview haben wir Dr. Taki gefragt, warum er sich mit der Entwicklung von Sonden beschäftigt, wie das FV3000 Red System bei der Lösung von Problemen hilft, die bei der Entwicklung von Sonden auftreten, und was die Zukunft für die NIR-Bildgebung bereithält.

Über Associate Professor Dr. Masayasu Taki

Dr. Taki hat an der Universität Osaka in Ingenieurwissenschaften promoviert und ist derzeit Assistenzprofessor am Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM) der Universität Nagoya.

Dr. Takis Forschungsinteressen liegen im Bereich der chemischen Biologie, insbesondere in der Entwicklung synthetischer chemischer Hilfsmittel zur Visualisierung spezifischer Biomoleküle und biologischer Phänomene unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Er hat mehrere Arbeiten über die Langzeitbildgebung mittels NIR-Fluoreszenz und den Nachweis von intrazellulären Ionen veröffentlicht.

F: Was ist der aktuelle Schwerpunkt Ihrer Forschung?

Dr. Taki: Mein Team und ich forschen hauptsächlich an der Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen für die Darstellung von Organellen und an der Entwicklung von Fluoreszenzsonden aus diesen Farbstoffen.

Ich glaube, dass es gewisse Unterschiede zwischen Fluoreszenzfarbstoffen und Fluoreszenzsonden gibt. Fluoreszenzfarbstoffe leuchten im Prinzip ununterbrochen, wohingegen Fluoreszenzsonden ihre Fluoreszenz aufgrund einer Reaktion ändern. Wir haben Fluoreszenzfarbstoffe und darauf aufbauend Sonden entwickelt, die Ereignisse innerhalb von Zellen erfassen können.

Derzeit interessieren wir uns besonders für die Lipide, aus denen Organellen bestehen. Kürzlich haben wir über die Entwicklung einer Sonde berichtet, mit der wir den Fettsäurestoffwechsel sichtbar machen können, und über ihre Anwendung in der Bildgebung. Fluoreszierende Proteine können zwar Membranproteine markieren, aber nicht die Lipidmembran an sich. Ich forsche an organischen Fluoreszenzfarbstoffen, weil ich überzeugt bin, dass ihre Stärken hier genutzt werden können. Und dann ist da noch die Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen und -sonden im nahen Infrarotbereich. Die NIR-Bildgebung mit fluoreszierenden Proteinen ist schwierig, daher können fluoreszierende Moleküle hilfreich sein.

F: Warum haben Sie sich auf die Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen und -sonden konzentriert?

Dr. Taki: Fluoreszierende Proteine sind für die Fluoreszenzbildgebung sehr nützlich. Wie bereits erwähnt, kann die Dynamik von Lipiden und Glykanen mit fluoreszierenden Proteinen jedoch nicht direkt dargestellt werden. Ein weiteres Problem ist, dass fluoreszierende Proteine leicht verblassen, so dass es schwierig ist, die Beobachtung über einen langen Zeitraum fortzusetzen.

Ursprünglich begann ich mit der Bildgebung während meines Studiums an der Northwestern University in den USA, wo die Mitarbeiter im Labor von Professor Thomas V. O'Halloran Zink-Fluoreszenzsonden synthetisierten. Ich fand das Leuchten der Moleküle im Inneren der Zellen absolut faszinierend, sodass ich schließlich mein Forschungsthema änderte, während der Professor im Urlaub war.

Seitdem beschäftige ich mich mit der Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen und -sonden. Eine Zeit lang forschte ich im Bereich der Bildgebung an Biometallen, doch als ich an die Universität Nagoya wechselte, begann ich mich zu fragen, wozu Moleküle speziell geeignet sind. Das brachte mich zu meiner derzeitigen Arbeit im Bereich der Beobachtung der Lipiddynamik und der NIR-Bildgebung.

F: Wie hilft Ihnen das FV3000 Red System bei der Durchführung Ihrer Experimente?

Dr. Taki: Einer der von uns entwickelten NIR-Fluorochrome ist PREX710, der einen Fluoreszenzpeak bei 740 nm aufweist. Die Empfindlichkeit des GaAsP-PMT-Detektors, der in gewöhnlichen konfokalen Mikroskopen verwendet wird und für gewöhnliche Fluoreszenzbeobachtungen durchaus ausreichend ist, fällt nach 750 nm stark ab. Daher ist dieser Detektor für NIR-Fluorochrome nicht geeignet. Mit dem FV3000 Red GaAs PMT-Detektor können nun auch NIR-Fluoreszenzfarbstoffe dargestellt werden, was bisher nur schwer möglich war. Ich gehe nun meine Experimente noch einmal durch, weil ich jetzt einige Dinge beobachten kann, die vor der Verwendung des FV3000 Red Systems ausgeschlossen waren.

Einer der Vorteile der FV3000 Red NIR-Lösung ist die Möglichkeit, die Anzahl der Beobachtungskanäle im Nahinfrarotbereich zu erhöhen. Der Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff, den wir gerade entwickeln, kann mit Silizium-Rhodamin (SiR) verwendet werden. Das sind chemische Verbindungen, die sich durch eine ausgezeichnete Lichtechtheit und eine geringe Schädigung der Zellen durch Lichtbestrahlung auszeichnen, sodass Organellenkontakte über einen langen Zeitraum beobachtet werden können. Die TruFocus Z-Drift-Korrektur des FV3000 Red Systems ist unverzichtbar, insbesondere wenn die Betrachtung mehrere Stunden dauert. Die Kombination aus Laser, Erkennungsempfindlichkeit und Z-Drift-Korrektur des FV3000 Red Systems ist sehr hilfreich.

Mehrfarbige Bildgebung von Mikrotubuli und endoplasmatischem Retikulum

F: Was ist Ihre Vision für die Zukunft der NIR-Bildgebung?

Dr. Taki: Ich denke, dass die meisten Forscher, die derzeit NIR-Bildgebung durchführen, diese für Betrachtungen in tiefen Schichten von biologischem Material nutzen. Natürlich ist es wichtig, die Nützlichkeit der Tiefenbildgebung zu demonstrieren, aber ich für meinen Teil würde gerne Forschung zur Bildgebung von Zellen betreiben. Phototoxizität, Verblassen von Fluoreszenz und Autofluoreszenz sind einige der Herausforderungen bei der Bildgebung von Zellen. NIR-Fluorochrome wie PREX710 können diese Probleme lösen. Wenn wir einen Fluoreszenzfarbstoff entwickeln, der mit dem 785-nm-Laser des FV3000 Red Systems kompatibel ist, wird die mehrfarbige Beobachtung im nahen Infrarotbereich möglich.

Die Fluoreszenz-Quantenausbeute von Fluoreszenzfarbstoffen im nahen Infrarotbereich ist jedoch nicht sehr hoch, und das Hauptproblem ist die geringe Leuchtdichte der Emission. Eine geringe Leuchtdichte bedeutet, dass die Anregungslaserleistung stärker sein muss, was die Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erhöht und die Zellen schädigt. Dadurch wird die Wirksamkeit von Nahinfrarotlicht halbiert.

Ich möchte herausfinden, warum solche Farbstoffe nicht leuchten, und indem ich dieses Problem löse, möchte ich Moleküle entwickeln und etwas schaffen, das Forscher auf der ganzen Welt nutzen möchten. Außerdem gibt es noch keine NIR-kompatible Sonde zur Beobachtung der Lipiddynamik, daher möchte ich als erster eine solche Sonde entwickeln. Wenn wir hervorragende Fluoreszenzfarbstoffe und -sonden entwickeln und es genügend Beispiele für die NIR-Bildgebung auf zellulärer Ebene gibt, werden mehr Forscher sie einsetzen, und ich möchte dazu beitragen, die biowissenschaftliche Forschung von der chemischen Seite her voranzubringen.

NIR-Lösungen für die konfokale Mikroskopie

Das FV3000 Red System erweitert die Möglichkeiten zur Wellenlängendetektion des Mikroskops FV3000 auf den NIR-Bereich. Durch Aufrüstung der einzelnen Bildgebungsmodule für die NIR-Detektion, d. h. Laser, Optik, Objektiv und Detektor, eignet sich das System FV3000 Red als spezielle Lösung für eine empfindlichere und genauere mehrfarbige NIR-Bildgebung.

Weitere Informationen über unsere NIR-Lösungen

Literaturnachweise

1. A negative-solvatochromic fluorescent probe for visualizing intracellular distributions of fatty acid metabolites
   K. Kajiwara, H. Osaki, S. Greßies, K. Kuwata, J-H. Kim, T. Gensch, Y. Sato, F. Glorius, S. Yamaguchi, M. Taki Nat. Commun., 13, 2533 (2022).
2. Late-stage Functionalisation of Alkyne-modified Phospha-Xanthene Dyes: Lysosomal Imaging Using an OFF-ON-OFF Type of pH Probe
   H. Ogasawara, Y. Tanaka, M. Taki, S. Yamaguchi
   Chem. Sci., 12, 7902-7907 (2021).
3. A Highly Photostable Near-Infrared Labeling Agent Based on a Phospha-rhodamine for Long-Term and Deep Imaging
   M. Grzybowski, M. Taki, K. Senda, Y. Sato, T. Ariyoshi, Y. Okada, R. Kawakami, T. Imamura, S. Yamaguchi Angew. Chem. Int. Ed., 57, 10137-10141 (2018).
4. A Highly Photostable Near-Infrared Labeling Agent Based on a Phospha-rhodamine for Long-Term and Deep Imaging
   M. Grzybowski, M. Taki, K. Senda, Y. Sato, T. Ariyoshi, Y. Okada, R. Kawakami, T. Imamura, S. Yamaguchi Angew. Chem. Int. Ed., 57, 10137-10141 (2018).

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