Organotypische Kleinhirnschnitte von Mäusen, 7 Tage nach Demyelinisierung. Die Axone sind dargestellt mit Neurofilament-H in grün, basischem Myelinprotein in rot und GSTpi in blau als Marker für Oligodendrozyten-Zellkörper. Bildquelle: Katherine Given, MS, University of Colorado Denver. Aufgenommen mit 20-facher Vergrößerung mit dem SLIDEVIEW VS200 Objektträgerscanner mit dem SILA Modul.
Weitfeld-Fluoreszenzmikroskope ermöglichen eine hochauflösende Bildgebung dünner Proben. Bei dickeren Proben ist die Abbildungsfähigkeit von Weitfeld-Mikroskopen jedoch aufgrund der Hintergrundfluoreszenz, die zu Bildunschärfe führt, eingeschränkt.
Wie also lässt sich die Bildunschärfe bei dickeren Proben entfernen? Die Antwort lautet: durch optische Schnitte. Mit dieser Methode werden die Einschränkungen der Weitfeld-Abbildung effektiv überwunden, allerdings ist hierfür normalerweise ein konfokales System oder eine Software zur Schärfung erforderlich.
Die optische Schnitttechnologie ist heute eine integrale Funktion von Objektträgerscannern für die Forschung. Forschende profitieren somit von den konfokalen Möglichkeiten zur Abbildung dicker Proben, und das bei einem deutlich höheren Durchsatz. Im Folgenden werden die Vorteile dieser optischen Schnittmethode im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren im Detail untersucht.
Wo liegen die Grenzen der Weitfeld-Bildgebung bei dicken Proben?
Die Weitfeldmikroskopie ist ein gängiges Bildgebungsverfahren, das bei dünnen Proben (< 10 µm) sehr effektiv ist. Bei der Weitfeldmikroskopie wird Licht aus fokussierten und aus unscharfen Ebenen von der Kamera erfasst. Bei dünnen Proben ist dies kein Problem. Bei der Bildgebung von dicken Proben führt diese unvermeidliche Hintergrundfluoreszenz zu Unschärfe und mangelndem Kontrast, sodass die relevanten Strukturen verdeckt werden.
Mit der konfokalen Mikroskopie und anderen Methoden der Rasterbeleuchtung lässt sich dieses Problem beheben, indem die Beleuchtung in ein festes Muster gebracht wird, wodurch ein optisch unterteiltes Bild entsteht. Diese Systeme können unter günstigen Bedingungen hervorragende Bilder erzeugen. Allerdings sind sie mit erheblichen Kosten verbunden. Sie hängen auch davon ab, dass gut definierte und kontrollierte Beleuchtungsmuster auf die Probe angewendet werden.
Eine andere Beleuchtungsmethode zur Abbildung dicker Proben
Um die Auswirkungen von Hintergrundfluoreszenz auf den Bildkontrast und die Bildqualität zu vermeiden, sind nicht immer genau definierte und kontrollierte Beleuchtungsmuster erforderlich. Bei einer als HILO-Mikroskopie bezeichneten Technik werden zufällige Speckle-Muster verwendet, um die fluoreszierende Probe zu beleuchten. Speckle-Muster weisen eine körnige Intensität mit einem inhärent hohen Kontrast auf, wodurch auch die mit Speckle-Beleuchtung aufgenommenen Fluoreszenzbilder mit körniger Struktur erscheinen. Diese Granularität sorgt für Kontrast und lässt direkt erkennen, wie fokussiert die Probe ist.
Bei der HILO-Bildgebung werden zwei Rohbilder erfasst und verarbeitet. Das erste ist ein normales Weitfeldbild mit gleichmäßiger Beleuchtung. Auf dieses Bild wird ein Hochpassfilter angewendet, um die Hochfrequenzinformationen zu extrahieren – der „HI“-Teil (High-Pass Filter) der HILO-Mikroskopie. Bei diesem Schritt werden Informationen mit niedrigen Frequenzen eliminiert, darunter nicht fokussierte und fokussierte Informationen.
Das zweite Bild wird mithilfe der Speckle-Beleuchtung aufgenommen, um die niederfrequenten, fokussierten Bildinformationen wiederherzustellen. Dies ist der „LO“-Teil (Low-Frequency) der HILO-Mikroskopie. Diese Bilder werden mit einem Algorithmus verarbeitet, der fokussierte Informationen extrahiert und die Hintergrundfluoreszenz eliminiert. Die beiden Bilder werden dann zusammengefügt (Abbildung 1), um ein Bild zu erhalten, das Informationen aus dem gesamten Frequenzbereich enthält, wobei das unscharfe Licht entfernt wurde.
Das SILA Modul ist eine Bildgebungslösung mit hohem Durchsatz für unsere SLIDEVIEW VS200 Objektträger-Scanner, die auf HILO-Mikroskopie basiert. Es handelt sich um eine Zusatztechnologie für Weitfeldmikroskope, die unscharfes Licht eliminiert. Insbesondere erzeugt es fokussierte optische Probenschnitte, vergleichbar mit der konfokalen Mikroskopie. Das SILA Modul kann problemlos zu jedem VS200 System hinzugefügt werden. Es bietet Vorteile für viele Anwendungen, bei denen eine hochwertige optische Abbildung dickerer Proben erforderlich ist.
Abbildung 1: Schnitt durch eine Mausniere bei 20-facher Vergrößerung. Das SILA Modul des VS200 Scanners kombiniert ein gleichmäßig beleuchtetes Bild mit Speckle-Beleuchtung, um ein kombiniertes Bild als scharfen optischen Schnitt zu erzeugen.
Einstellbare optische Schnitttechnologie mit nur einem Parameter
Da das SILA Modul das herkömmliche Weitfeldbild und das Speckle-Bild mathematisch verarbeitet, kann der optische Schnitt mithilfe eines einzigen Parameters, der Schnittdicke (ST), angepasst werden. Wenn der ST-Wert hoch eingestellt ist, weisen die Bilder eine höhere Tiefenschärfe auf. Dadurch entsteht der Eindruck eines Weitfeldbildes.
Abbildung 2 zeigt einen Gehirnschnitt, der bei ST5 entnommen wurde. Bei diesem hohen ST-Wert bleiben viele unscharfe Bereiche erhalten. Wenn der ST-Wert abnimmt, weist das Bild dagegen eine geringere Tiefenschärfe auf. Bei der Betrachtung des bei ST2 und ST1 aufgenommenen Hirnschnitts bleiben also die fokussierten Informationen erhalten, während die unscharfen Elemente eliminiert sind.
Die Möglichkeit, den optischen Schnitt auf diese Weise zu optimieren, ermöglicht die Visualisierung in verschiedenen Tiefen und entfernt gleichzeitig die Hintergrundfluoreszenz. Diese Funktion des SILA Moduls für den VS200 Scanner ist mit konfokalen Mikroskopsystemen vergleichbar, bei denen durch die Änderung der Lochfeldblende ein ähnlicher Effekt erzielt werden kann.
Abbildung 2: Mit tdTomato markierte Mausgehirnprobe, aufgenommen bei 20-facher Vergrößerung.
Entfernen von Unschärfe in dicken Proben: SILA Bildgebung und andere Techniken im Vergleich
Vor der Entwicklung des SILA Moduls verfügten VS200 Scanner über eine alternative Lösung zum Entfernen des unscharfen Lichts aus Weitfeldbildern. Mit der TruSight Dekonvolutionssoftware können Bilder mithilfe von 2D-CI-Algorithmen (CI = Constrained-Iterative) dekonvolviert werden. Mit diesem softwarebasierten Ansatz kann ein Teil des unscharfen Lichts entfernt werden. Er entfernt jedoch nicht so viel unscharfes Licht und bietet auch nicht die optische Schnittoptimierung wie die kombinierte Software und Hardware, die im SILA Modul verwendet wird.
Die Dekonvolution stellt jedoch eine brauchbare Zwischenoption für die Anzeige dünnerer Proben dar, für die die optische SILA Schnitttechnik nicht verfügbar ist. Die Unterschiede in der Bildqualität zwischen herkömmlichen Weitfeld-, Software-dekonvolvierten und SILA Bildern sind in Abbildung 3 zu sehen.
Abbildung 3: Kompletter Plattwurm (Schmidtea mediterranea) in 20-facher Vergrößerung, mit Darstellung des Darms. Blau: DAPI. Grün: innere Darmzellen. Rot: äußere Darmzellen. Bildquelle: Amrutha Palavalli, Abteilung Gewebedynamik und Regeneration, Max-Planck-Institut, Göttingen, Deutschland.
SILA Bildgebungsanwendungen: Von dicken Zellschichten bis zu Gewebeproben
Das optische SILA Modul kann für viele Forschungsanwendungen einen erheblichen Mehrwert bringen, insbesondere bei der Bildgebung fixierter, dicker Zellschichten und Gewebeproben. Mit Funktionen zur Optimierung der Schnittführung sowie einer vergleichbaren Unschärfeunterdrückung und einem vergleichbaren Bildkontrast wie bei konfokalen Mikroskopen bietet das SILA Modul eine Bildgebung hoher Qualität bei deutlich höherem Durchsatz.
Die Möglichkeit, dickere Proben abzubilden, ist ein Vorteil in der neurowissenschaftlichen Bildgebung, wo oft dicke Gewebeschnitte erforderlich sind, um die Morphologie der Probe zu erkennen. Die Abbildung von Gehirnschnitten ist bekanntermaßen eine Herausforderung. Dies ist besonders schwierig, da das Hirngewebe dazu neigt, einen Lichtstreueffekt zu erzeugen.
Normalerweise wären konfokale oder Zwei-Photonen-Mikroskopiesysteme erforderlich, um ein qualitativ hochwertiges, kontrastreiches Bild aufzunehmen. Allerdings benötigen diese Systeme viel Zeit, um große Bereiche, wie etwa einen Gehirnschnitt, abzubilden. Das automatische Objektträger-Scannen mit dem VS200 System mit SILA Modul beschleunigt die Abbildung dicker Proben über einen großen Bereich erheblich. Das Ergebnis sind hochwertige Bilder in einem Bruchteil der Zeit (Abbildung 4).
Abbildung 4: 200 μm Mausgehirnschnitt. Übersicht mit 4X Vergrößerung. Das Bild wurde bei 2X Vergrößerung aufgenommen, der detaillierte Scan ist ein Extended Focal Image (EFI) einer 47 µm Z-Serie, aufgenommen bei 20-facher Vergrößerung. Blau: DAPI. Grün: GFAP (Glia). Gelb: MAP2 (Neuronen).
Die Organoidforschung ist ein weiterer Bereich, der von der SILA Bildgebung profitiert, da die Bildgebung von Organoiden ähnliche Herausforderungen wie die Neurowissenschaften stellt. Die Abbildung von Organoiden ist aufgrund der dicken Proben eine Herausforderung. Zudem müssen große Bereiche abgebildet werden, damit die Morphologie der Organoide untersucht werden kann.
Als Objektträgerscanner kann das VS200 System mit dem SILA Modul die nötige Abdeckung bieten, um diese großen Proben abzubilden. Die automatische Bildverarbeitung, die probenunabhängige Punktspreizfunktion (PSF) und der einfache Arbeitsablauf sorgen für eine schnelle Bildaufnahme. Das SILA Modul ist auch für die Krebsforschung, die räumliche Biologie, die Botanik, die Embryologie und viele andere Anwendungen von Nutzen, bei denen eine Bildgebung dicker Proben über große Flächen in hoher Qualität erforderlich ist.
Wesentliche Vorteile der SILA Bildgebung
Die SILA Bildgebung kann einen optischen Schnitt optimieren, die Unschärfe der Probe reduzieren und den Bildkontrast verbessern, vergleichbar mit hochentwickelten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopen. Der VS200 Objektträgerscanner mit SILA Modul bietet im Vergleich zu konfokalen Systemen einen deutlich höheren Durchsatz und ermöglicht die schnelle Bildgebung großer und bislang schwierig abzubildenden Proben, was erhebliche Vorteile zum Beispiel für die Neurowissenschaft, die Organoidforschung usw. bedeutet.
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