Auf der Suche nach neuen Erkenntnissen darüber, wie Geist und Körper funktionieren, müssen Wissenschaftler tiefer blicken als je zuvor. Die Multiphotonenmikroskopie entwickelt sich derzeit zu einer beliebten Technik, um genau das zu tun. Dieses leistungsfähige Bildgebungsverfahren ermöglicht die nichtinvasive 3D-Abbildung von dynamischen zellulären Vorgängen tief im Lebendgewebe.
Dennoch übersehen Wissenschaftler häufig ein optisches Problem, das bei der Multiphotonen-Anregung für Deep Imaging auftritt – die sphärische Aberration.
Hier werfen wir einen genauen Blick auf die sphärische Aberration bei der Multiphotonen-Anregung für Deep Imaging und diskutieren, wie man sie überwinden kann.
Was ist sphärische Aberration?
Einfach gesagt ist die sphärische Aberration ein optischer Fehler, der auftritt, wenn Licht eine sphärische Linse passiert und an unterschiedlichen Punkten konvergiert. Da sich die Strahlen nicht in einem Brennpunkt treffen, werden die Bildhelligkeit und die Auflösung beeinträchtigt. So erschwert sphärische Aberration unter anderem die Untersuchung feiner Strukturen wie zum Beispiel von Dornenfortsätzen in tiefen Regionen des Gehirns.
Glücklicherweise können Innovationen in der Mikroskopobjektiv-Technologie diesen Fehler kompensieren. Wissenschaftler können Korrekturringe an den Objektiven verwenden, um die Position der internen Linsenelemente zu verschieben und die sphärische Aberration zu korrigieren. Allerdings ist die manuelle Kompensation der sphärischen Aberration beim Deep Imaging mithilfe eines Korrekturrings alles andere als einfach.
Hier sind zwei häufige Probleme:
- Die Dunkelkammerumgebung von Multiphotonensystemen macht es schwierig, die Position des Rings zu erkennen und einzustellen.
- Jede Einstellung des Rings verändert geringfügig die effektive Brennweite des Objektivs.
Diese Herausforderungen erschweren bei der Volumenerfassung von Z-Stapel-Bildern die manuelle Einstellung eines Korrekturrings für mehr als eine Position – was die Möglichkeit, in jeder Tiefe helle und hochauflösende Bilder aufzunehmen, einschränken kann.
Um diese Schwierigkeit zu überwinden, empfehlen wir, ein motorgesteuertes Linsensystem wie unsere TruResolution-Objektive zu verwenden. Sie bieten die folgenden zwei Vorteile:
1. Vereinfachte Bedienung.
Die Multiphotonenmikroskopie ist eine hochmoderne Fluoreszenz-Bildgebungstechnik, weshalb sich manche Wissenschaftler bei der Aufnahme von Bildern ohne Hilfe durch einen Experten unsicher fühlen. Mit motorgesteuerten Objektiven lässt sich die Korrektur der sphärischen Aberration automatisieren, was die Bedienung durch den Anwender bei Multiphotonennanregung für Deep-Imaging-Experimenten deutlich vereinfacht. Und so funktioniert es:
Wie in der Abbildung unten erkennbar ist, ändert sich beim Drehen herkömmlicher Korrekturringe die Brennebene (Abbildung A, links). Im Vergleich dazu ändert sich bei motorgesteuerten Objektiven deren Z-Position automatisch mit dem Drehwinkel. Außerdem wird eine Optimierung anhand objektiv gemessener Werte, z. B. des Bildkontrasts, durchgeführt (Abbildung B, rechts).
Mit dieser innovativen Technologie vereinfacht die Software-Steuerung die Bedienung des Mikroskops unter einer Vielzahl externer Bedingungen.
Den Unterschied zeigen die folgenden beiden Bilder von Mikroglia des visuellen Cortex einer lebenden Maus in 100 µm Tiefe. Im Vergleich zu dem vor der Korrektur aufgenommenen Bild (links) ist das nach automatischer Korrektur mit dem Korrekturring erfasste Bild heller, und die feinen, filopodienartigen Ausstülpungen sind besser aufgelöst (rechts).
Bilder mit freundlicher Genehmigung von Mitchell Murdock, Massachusetts Institute of Technology (MIT).
2. Erstellung heller, kontrastreicher Bilder in jeder Tiefe.
Mit einem automatisierten Korrekturring können optische Korrekturen an Tiefen- oder Brechungsindexprofile angepasst werden, was die Erfassung hellerer Bilder und feinerer Merkmale tief in biologischen Geweben wesentlich erleichtert.
Neurowissenschaftler interessieren sich beispielsweise für die strukturelle Morphologie von Merkmalen im Submikrometerbereich, wie z. B. die Kopf- und Halsstrukturen von Dornenfortsätzen in tiefen Hirnregionen. Mit kontrastreicheren und schärferen Bildern können diese Dornenfortsätze im Rahmen von Untersuchungen zu Lernen und Gedächtnis besser charakterisiert werden.
So sieht das in der Praxis aus. In einer aktuelleren Studie führten Wissenschaftler In-vivo-Untersuchungen am sensorischen Cortex einer anästhetisierten Maus durch, in deren Schädeldach ein Glasfenster eingesetzt worden war.
Bilder mit freundlicher Genehmigung von Hiromu Monai, Hajime Hirase und Atsushi Miyawaki, RIKEN BSI-Olympus, Japan.
Das mit einem automatischen TruResolution-Objektiv aufgenommene Bild (oben rechts, B) weist eine höhere Auflösung und Helligkeit auf als das Bild, das mit dem an der Oberfläche fixierten Korrekturring aufgenommen wurde (Mitte rechts, C).
Dank der verbesserten Bildqualität des TruResolution-Objektivs sind Details der Dornenfortsätze leichter zu erkennen (unten links, D) als im Bild, das mit dem fixierten Korrekturring aufgenommen wurde (unten rechts, E).
Entdeckungen in größerer Tiefe
Multiphotonen-Imaging tiefer in Geweben kann Wissenschaftlern dabei helfen, neurologische Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Multiple Sklerose besser zu verstehen. Unsere motorgesteuerten Objektive für das Multiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskop FVMPE-RS liefern die klaren, hellen und präzisen Bilder, die Sie brauchen, um sich auf die Details zu konzentrieren und die nächste einschneidende Entdeckung zu machen.
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