Olympus bietet hochwertige optische Dunkelfeldkomponenten an, beispielsweise die UPlanFL 60X und 100X Ölimmersionsobjektive. In Kombination mit einem ölgekoppelten Dunkelfeldkondensor erzeugen diese Objektive Bilder mit verbesserter Partikeldetektion und einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zur Standard-Durchlichtmikroskopie. Für die Nanoforschung mit ihren sich stetig erweiternden Anforderungen sind jedoch Objektive mit noch besseren Dunkelfeldeigenschaften notwendig.
Eine Einführung in die erweiterte Dunkelfeldbeleuchtungstechnik
Um dieser Nachfrage gerecht werden zu können, führte CytoViva im Jahr 2005 die erweiterte Dunkelfeldbeleuchtungstechnik (EDF) ein (US-Patent Nr. 7.542.203, 7.564.623 [2009]). Diese Technik erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis um das 10-Fache im Vergleich zu herkömmlichen Dunkelfeldbildgebungsverfahren. Dadurch können Objekte im Nanobereich viel besser erkannt werden.
Mit der CytoViva EDF-Beleuchtung können Objekte in Nanogröße in verschiedenen transparenten und transluzenten Probenumgebungen in ihrem ursprünglichen Zustand – markerfrei – schnell und einfach untersucht werden, wie die nachstehende Abbildung 1 zeigt. Zu sehen sind Makrophagenzellen in Kontakt mit Low-Density-Lipiden (LDL), die mit Goldnanopartikeln (AuNPs) beladen sind.
Abbildung 1a: LDL AuNPs in Makrophagenzellen im erweiterten Dunkelfeld (60X)
Abbildung 1b: 4-facher Digitalzoom des rot markierten Bereichs
Abbildung 1c: Kontrollzelle
Erweiterte Dunkelfeldbeleuchtung eröffnet neue Möglichkeiten für die Bildgebung im Nanobereich
Diese verbesserte Leistung bringt neue Möglichkeiten mit sich. So können Forscher beispielsweise Nanokonstrukte in einer Vielzahl von transluzenten Probenmatrizen mit verbesserter Klarheit und Genauigkeit optisch abbilden. Zum Beispiel:
- Plasmonische Partikel (Au, Ag, Pt) mit einer Größe von nur 10–20 nm
- Metalloxide (TiO2, Fe2O3, ZnO2) mit einer Größe von nur 20–40 nm
- Polymere Partikel mit einer Größe von nur 40–60 nm
- Lipide mit einer Größe von nur 80–100 nm
Mit dieser Technik lassen sich auch andere Konstrukte im Nanobereich, z. B. ein- und mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren, leicht abbilden. Auch hier ist vor der Bildgebung keine Markierung oder sonstige spezielle Probenvorbereitung erforderlich. Außerdem ist die Technik leicht anzuwenden. Einsteiger können auch ohne vorherige Erfahrung in der Mikroskopie in weniger als einer Stunde lernen, qualitativ hochwertige Bilder zu erstellen.
Erweiterte Dunkelfeldbeleuchtung: Funktionsweise
Die verbesserte Leistung wird durch die Umgehung des normalen Strahlengangs durch das Mikroskopstativ erreicht. Stattdessen lenkt das geschlossene System das Licht direkt in den Kondensor, wobei die Geometrie des Strahlengangs von der Lichtquelle bis zum Eintrittsspalt des Kondensors festgelegt ist (Abbildung 2a). Dadurch wird die maximale Photonendichte auf die Probe fokussiert, was eine Abbildung mit einem verbesserten SNR ermöglicht. Darüber hinaus ist die Fokussierung des Kondensors auf die gewünschte Abbildungsebene der Probe dank dieser Konstruktion einfacher und konsistenter.
Abbildung 2a: Strahlengang durch die Beleuchtungseinheit für erweiterte Dunkelfeldbeleuchtung von CytoViva
Die EDF-Konstruktion kollimiert auch das in den Kondensor eintretende Licht. Dadurch werden Streulicht und Hintergrundgeräusche reduziert. Das Ergebnis ist ein optimiertes Dunkelfeldbild mit einem verbesserten SNR im Vergleich zu handelsüblichen Dunkelfeldkondensoren. Die EDF-Beleuchtungseinheit ist mit verschiedenen aufrechten und inversen Mikroskopen von Olympus kompatibel, zum Beispiel:
- BX43 aufrechtes manuelles Mikroskop
- BX53 aufrechtes halbmotorisiertes Mikroskop
- IX73 inverses Mikroskop
Die von CytoViva entwickelte EDF-Beleuchtungseinheit funktioniert auch mit verschiedenen Lichtquellen, deren Leistung zwischen 400 und 2200 nm liegt. Dazu gehören Lichtquellen, die für die Fluoreszenzbildgebung optimiert sind.
Abbildung 2b: Beleuchtungseinheit für erweiterte Dunkelfeldbeleuchtung von CytoViva an einem aufrechten Olympus Mikroskop
Die Technik für erweiterte Dunkelfeldbeleuchtung kann für eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Nanotechnologie eingesetzt werden – von alternativen Energien bis hin zu Kosmetika. Alle diese Anwendungen haben ihre eigenen, einzigartigen Anforderungen. Allen gemeinsam ist jedoch die Notwendigkeit, die Bildung, Funktion und Lokalisierung von Nanokonstrukten in ihrem nativen, markerfreien Zustand optisch zu untersuchen, wenn sie in verschiedene biologische und nicht-biologische Matrizen eingebracht werden. Wie hier gezeigt, ist die Beleuchtungseinheit für die erweiterte Dunkelfeldbeleuchtung von CytoViva in Verbindung mit der hochwertigen Mikroskopieausrüstung von Olympus der Schlüssel zum Erfolg bei diesen anspruchsvollen Anwendungen.
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