Während meiner Zeit bei Olympus haben mich die kreativen Aufbauten der Konfokalmikroskope unserer Kunden immer wieder erstaunt – von selbstkonstruierten Probenhaltern bis hin zu experimentellen Apparaturen. Und da unser FV3000 Konfokalmikroskop sowohl in aufrechter als auch in invertierter Konfiguration erhältlich ist, können Proben auf vielfältige Weise platziert und ausgerichtet werden.
Das FV3000 Mikroskop wurde für die Fluoreszenzmikroskopie entwickelt.Mit ein wenig Einfallsreichtum kann es jedoch in einigen Fällen auch für die konfokale Reflexionsbildgebung genutzt werden. Das Verfahren der konfokalen Reflexionsbildgebung wird trotz seiner Anpassungsfähigkeit und Zweckmäßigkeit oft übersehen. Daher möchte ich hier eine intelligente Art und Weise ihrer Verwendung vorstellen, um Ihnen zu zeigen, wie Sie mehr aus Ihrem System herausholen können.
Vor allem werde ich darauf eingehen, wie die konfokale Reflexionsbildgebung zur Extraktion endogener Informationen aus biologischen Geweben eingesetzt werden kann.
Konfokale Reflexionsbildgebung an fibrillären Biomolekül-Komplexen
Ein Einsatzbereich für einen Reflexionsstrahlengang ist die Erfassung endogener Signale, um zusätzlichen Kontrast zu erzielen und die Probenumgebung erkennbar zu machen.
Und so funktioniert es: Die Grenzfläche zwischen biologischen fibrillären Proteinstrukturen und Wasser erzeugt ein starkes reflektiertes Kontrastsignal. Durch einfaches De-Scanning des Anregungslichts zu einem TruSpectral-Detektor, der auf eine überlappende Bandbreite eingestellt ist, können spezielle Zellstrukturen, der Organisationszustand der extrazellulären Matrixumgebung oder Materialoberflächenmerkmale untersucht werden.
Praktischerweise verfügt das FV3000 Konfokalmikroskop über einen vollständig spektralbasierten Strahlengang, so dass alle Kanäle zur Reflexionsdetektion verwendet werden kann. In Kombination mit Fluoreszenzbeobachtungen ermöglicht diese zusätzliche multispektrale Reflexionsfunktionalität die Extraktion der Position von unmarkierten Zellstrukturen.
Ein Beispiel: Ich habe einen Objektträger mit einem immunfluoreszenzmarkierten fixierten Hirnschnitt einer Ratte von EnCor Biotechnology, Inc. aufgenommen. Wie in den Bildern unten (Abbildung 1) zu sehen ist, zeigt eine Standard-Dreikanal-VBF-Aufnahme eine ausgezeichnete epitopspezifische Markierung von neuronalen Dendriten (orange), katecholaminergen Neuronen, die Dopamin oder Noradrenalin enthalten (magenta), und eine Färbung der Zellkerne durch ein interkalierendes Färbemittel (cyan).
Abbildung 1: Dreifarbiger immunfluoreszenzmarkierter Hirnschnitt einer Ratte, angefärbt mit Antikörpern, von EnCor Biotechnology, Inc. Oben: Einzelbild in Z-Ebene des gesamten Sehfeldes, aufgenommen mit einem 20fach X Line Objektiv. Unten: Echte Pixelauflösung in einem hervorgehobenen quadratischen Ausschnitt.
Trotz des starken Fluoreszenz-Hintergrunds in einem breiten Spektralbereich, der durch das immunfluoreszenzmarkierte Präparat erzeugt wird, kann die Reflexionsfunktionalität genutzt werden, um noch mehr endogene Informationen „herauszukitzeln“.
Durch die gleichzeitige Verwendung von vier Kanälen, um Reflexionen der Laserwellenlängen 405, 488, 561 und 640 nm abzubilden, lässt sich ein multispektrales Übersichtsbild der myelinisierten Neuronen in diesem Gewebe erstellen. Wie das aussieht, sehen Sie auf den folgenden Bildern (Abbildung 2 und 3).
 Abbildung 2 (links): Zusammenfügen der in Abbildung 1 dargestellten Immunfluoreszenzsignale von drei Kanälen. Rechts: Darstellung der zusammengefügten, durch konfokale Reflexionsbildgebung mit vier Kanälen gleichzeitig aufgenommenen Reflexionen der Laserwellenlängen 405, 488, 561 und 640 nm im selben Sehfeld. |  Abbildung 3 (oben): Gleichzeitig aufgenommene konfokale Einzelreflexionsbilder der verschiedenen Wellenlängen. Unten: Zusammengefügte Bilder der immunfluoreszenzmarkierten dopaminhaltigen Neuronen und des multispektralen konfokalen Reflexionsbildes der endogenen Axonmyelinisierung. |
Sie können diese Informationen, die ohne Markierung zugänglich sind, zur Beurteilung des Myelinisierungsgrades der selektiv immunfluoreszenzmarkierten Neuronen verwenden oder sie im Rahmen von Anwendungen nutzen, die Axon-Tracing erfordern.
Konfokale Reflexionsbildgebung kann auch eingesetzt werden, um die extrazelluläre Matrix von 3D-Gewebekulturmodellen zu untersuchen. Wie in den Bildern unten zu sehen ist (Abbildung 4), interagieren die während der Angiogenese gewachsenen neuen Gefäße eng mit den benachbarten Kollagenfibrillen des umgebenden Stromas.
Abbildung 4: Z-Projektion eines 3D-gedruckten Blutgefäßes in einer Kollagenmatrix. Oben: Konfokales Fluoreszenzbild von rhodaminmarkierten Endothelzellen. Mitte: Konfokales 405-nm-Reflexionsbild mit Darstellung des Kollagenfasernetzwerks und von Bereichen mit Remodellierung in Gefäßnähe. Unten: Zusammengefügtes Bild. Maßstabsbalken entspricht 100 µm.
Die Untersuchung der nativen Angiogenese in vitro an isolierten Mikrogefäßen (mit Angiomics™ von Advanced Solutions Life Sciences) mit dem FV3000 Konfokalmikroskop zeigt, dass die angiogenen, neu gebildeten Gefäße (dargestellt durch konfokale Fluoreszenz) die unmittelbar benachbarten Kollagenfibrillen (dargestellt durch Reflexionsbildgebung) reorganisieren, während sie in der 3D-Stromaumgebung wachsen.
