Da Forschungseinrichtungen den zeitlichen Aufenthalt im Labor begrenzen, um räumliche Distanzierung zu wahren und die Sicherheit der Mitarbeiter zu gewährleisten, ist die Fähigkeit, die Lebendzell-Bildgebung so weit wie zu automatisieren und zu rationalisieren, wichtiger denn je, um produktiv zu bleiben.
Bei der Optimierung der technischen Ausstattung muss jedoch vieles berücksichtigt werden, um unerwartete Situationen zu vermeiden, die möglicherweise einen erneuten Aufenthalt im Labor erfordern.
Die folgenden 4 Tipps können dabei helfen:
1. Bewahren Sie die Proben an einem warmen Ort mit stabilen Umgebungsbedingungen auf.
Eine der größten Herausforderungen bei der Bildgebung von Lebendzellen besteht darin zu erreichen, dass die Proben auch auf dem Mikroskoptisch, d. h. außerhalb des Inkubators, gesund bleiben und sich normal verhalten.
Die Proben können dazu in speziellen Mikroskop-Inkubatoren oder in geschlossenen Inkubatoren mit einheitlicher Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO2-Dichte für Zellen aufbewahrt werden.
Wichtig dabei ist, das Objektiv zu erwärmen, denn ein schädlicher Kältekontakt mit den Proben ist eine häufige Fehlerquelle.
Ein weiterer Punkt ist, dass die periphere Region von Mikrotiterplatten im Vergleich zur Mitte stärkeren Schwankungen der Umgebungsbedingungen ausgesetzt sein kann. Verwenden Sie daher unbedingt die Vertiefungen in der Mitte und meiden Sie die Vertiefungen am Rand, um die Stabilität zu verbessern. Wenn Sie beispielsweise eine Platte mit 96 Vertiefungen (12 × 8 Vertiefungen) verwenden, verwenden Sie für die Untersuchung nur die 60 Vertiefungen (10 × 6 Vertiefungen) in der Mitte.
Abbildung 1: Tisch-Inkubator.
2. Achten Sie auf eine stabile Umgebungstemperatur, um den Fokus zu verbessern.
Ein weiterer, zu berücksichtigender Faktor ist die Raumtemperatur, da schon kleine Veränderungen die Bildgebungsleistung beeinträchtigen können.
Eine stabile Temperatur in der Umgebung des Mikroskops ist besonders für die Betrachtung von Lebendzellen mit hoher Vergrößerung wichtig. Da die Schärfentiefe bei Betrachtung mit hoher numerischer Apertur (NA) gering ist, kann ein System selbst bei kleinem Z-Drift, der durch Temperaturänderungen verursacht wird, aus dem Fokus geraten.
Zur Optimierung der Umgebungsbedingungen ist darauf zu achten, dass die Klimaanlage funktioniert und die Raumtemperatur stabil ist, bevor mit der Untersuchung begonnen wird. im Sinne einer besseren Stabilität sollte außerdem kein direkter Luftstrom der Klimaanlage zum Mikroskop vorhanden sein.
3. Stellen Sie die Fokussierung und den Korrekturring genau ein, um die Bildqualität zu verbessern.
Eine andere Möglichkeit, zeitliche Schwankungen wie die Z-Drift-Abweichung zu beheben, ist eine möglichst genaue Einstellung des Fokus und des Korrekturrings vor Beginn der Untersuchung von Lebendzellen.
Häufig wird zwar der Fokus sorgfältig eingestellt, aber der Korrekturring vergessen. Der Korrekturring kann jedoch die Bildqualität erheblich verbessern, insbesondere bei der Betrachtung von tieferen Gewebeschichten oder bei Verwendung eines Objektivs mit hoher NA.
Die ideale Position des Korrekturrings hängt von vielen Faktoren ab, zum Beispiel vom Brechungsindex der Probe, der Tiefe der Betrachtungsebene und der Dicke des Deckglases. Das Deckglas und der Glasboden von Petrischalen haben oft, aber nicht immer, eine Dicke von 170 µm, und auch bei Kunststoffbehältnissen muss von anderen Werten ausgegangen werden.
Der Korrekturring sollte daher immer genau eingestellt werden, indem der Bildkontrast überprüft wird, besonders bei der Verwendung von Mikrotiterplatten oder Behältern aus Kunststoff.
Normalerweise muss der Korrekturring selbst eingestellt werden. Bei Untersuchungen, bei denen proaktive Anpassungen des Korrekturrings erforderlich sind (z. B. bei der Betrachtung von tiefen Gewebeschichten mit einem Multiphotonen-Mikroskop), kann das bedeuten, dass mehr Zeit im Labor verbracht werden muss. Die gute Nachricht ist, dass diese Einstellungen mit einem motorgesteuerten Korrekturring automatisierbar sind.
Abbildung 2: Korrekturring an einem Objektiv mit Indikator für die Dicke des Deckglases.
Erfahren Sie in unserem Blogartikel mehr über motorgesteuerte Objektivsysteme für Deep Imaging: Wie sich Deep Imaging in der Multiphotonenmikroskopie verbessern lässt.
4. Verwenden Sie ein spezielles Fokusmodul, um die Proben scharf darzustellen.
Was aber, wenn eine Z-Drift-Abweichung auftritt?
Selbst wenn alle oben genannten Schritte durchgeführt wurden, ist das Bild möglicherweise nicht immer scharf. Schließlich können viele Faktoren eine Z-Drift-Abweichung verursachen. Dies kann durch eine proaktive und absichtliche Veränderung verursacht werden, wie etwa durch das Hinzufügen von Chemikalien, sowie durch physische Vibrationen aufgrund von Personen, die im Raum umhergehen, oder durch eine Änderung der Raumtemperatur.
Auch wenn die meisten motorgesteuerten Mikroskope über eine Autofokus-Funktion basierend auf dem Bildkontrast verfügen, weisen sie Grenzen auf:
- Begrenzter Einstellbereich
- Anregungslicht für die Kontrast-basierte Fokussierung verursacht Phototoxizität
Eine Methode zur Sicherstellung der Fokussierung bei Untersuchungen mit Lebendzellen ist die Verwendung eines speziellen Fokusmoduls wie TruFocus, eines auf Nahinfrarot-Laser (NIR) basierenden Z-Drift-Kompensators. NIR-Licht kann zudem die Phototoxizität und das Übersprechen der Bildwellenlänge bei längerer Betrachtung minimieren.
Der One-Shot-Autofokus-Modus (AF) des Moduls verhindert unnötige Beleuchtung, während der kontinuierliche AF-Modus zur Betrachtung oder für eine kontinuierlichen Bilderfassung dynamischer Phänomene in Echtzeit verwendet werden kann.
Abbildung 3: Scharfe Darstellung von Proben mit dem TruFocus Z-Drift-Kompensator von Olympus.
Das folgende Video zeigt, wie die Z-Drift-Kompensation für die Langzeit-Bildgebung funktioniert:
Für produktive und effiziente Untersuchungen von Lebendzellen
Es gibt immer etwas zu tun! Wir hoffen, unsere Tipps sind hilfreich, um produktiv zu bleiben, eine längere Lebendzell-Bildgebung zu erzielen und alle wissenschaftlichen Arbeiten fortzusetzen. Kontaktieren Sie uns bei Fragen zur Automatisierung Ihres Labors!
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