Visualisierung von DNA-Reparatur-Proteinen mit dem konfokalen Mikroskop FV3000
Bildgebung lebender U2OS-Zellen nach laserinduzierter DNA-Schädigung
Doppelsträngige DNA-Brüche gehören zu den schwersten Formen von DNA-Schäden. Als Reaktion auf die Schädigung werden in der Zelle DNA Damage Response(DDR)-Mechanismen ausgelöst, die DDR-Faktoren an der Bruchstelle aktivieren und zur Signalisierung an Zellzyklus-Kontrollpunkten und zur Regulierung von DNA-Reparaturaktivitäten führen. Die sofortige und sorgfältige Signalisierung und Reparatur der Bruchstelle sind entscheidend für die Lebensfähigkeit der Zelle und verhindern Mutationen, die zur Entwicklung von Krebs führen können. Daher ist das Verständnis der Mechanismen, die am DNA-Reparaturprozess beteiligt sind, von entscheidender Bedeutung. In dieser Anwendung verwendeten wir humane Osteosarkom-Epithelkrebszellen (U2OS), um die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen bei laserinduzierten Schäden, beispielsweise DNA- Doppelstrangbrüchen, mit dem konfokalen Mikroskop FV3000 zu untersuchen. Mit den Bildern konnten wir (1) die Kinetik und Akkumulationsebenen der für die Bruchstellen aktivierten Reparaturproteine bestimmen und (2) die Kolokalisierung endogener Transkriptionsregulatoren und Faktoren des DDR-Mechanismus an DNA-Bruchstellen charakterisieren.
Abb. 1: Aufbau des Versuchsprotokolls
MRE11-cDNA wird in einen Expressionsvektor mit GFP-Tag geklont, der dann in U2OS-Zellen transfiziert wird. Nach der Sensibilisierung mit Bromdesoxyuridin (BrdU) oder Hoechst wird die DNA-Schädigung durch zeilenweise Abtastung des interessierenden Bereichs (ROI) im Zellkern mit dem 405 nm-Laser des Mikroskops FV3000 induziert. Anschließend erfolgt eine Bildgebung der lebenden Zellen mit dem 488 nm-Laser, um die Rekrutierungskinetik von MRE11 als Reaktion auf die laserinduzierte Schädigung zu überwachen.
Bildgebungsbedingungen
Objektiv: Superkorrigiertes 60x Ölimmersionsobjektiv (PLAPON60XOSC)
Mikroskop: Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop FLUOVIEW FV3000
Laser: 405 nm (ROI-Anregung), 488 nm (GFP, grün)
Schonende Bildgebung von lebenden Zellen für quantitative Messungen
Eine wiederholte Exposition mit Anregungslaserlicht bei Zeitrafferaufnahmen kann zu Fotobleichung und Fototoxizität führen und die Gewinnung quantitativer Daten aus dem Versuch erschweren. In unserem Protokoll mussten wir einen Kompromisszwischen starker Laserstimulation und schonender Bildgebung lebender Zellen finden, um die Dynamik von Reparaturproteinen unmittelbar nach laserinduzierten DNA-Schäden quantifizierbar zu erfassen. Eingesetzt wurde dazu das konfokale Mikroskop FV3000 mit der TruSpectral-Detektionstechnologie von Olympus und hochempfindlichen GaAsP-Detektoren, um die Laserleistung für die kontinuierliche Darstellung unserer lebenden Zellen zu minimieren. Zusätzlich haben wir das TruFocus-Modul eingesetzt, um den Fokus während des gesamten Bildgebungsversuchs aufrechtzuerhalten. In ihrer Kombination erhielten wir mit diesen Technologien genaue und quantifizierbare Zeitrafferdaten über die schadensabhängige Akkumulation des DDR-Faktors MRE11 an DNA-Bruchstellen.
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Abb. 2: Schadensabhängige Akkumulation von MRE11 an der DNA-Bruchstelle
Die DNA von U2OS-Zellen, die GFP-MRE11 exprimieren, wurde mit einem 405 nm-Laser gezielt geschädigt, anschließend erfolgte eine Zeitrafferaufnahme des GFP mit dem 488 nm-Laser. Die Zellen wurden 6 Minuten lang in 20-Sekunden-Intervallen aufgenommen, um die Lokalisierung von MRE11 vor und nach der DNA-Schädigung zu visualisieren und zu quantifizieren.
Genaue Kolokalisierungsanalyse durch ein superkorrigiertes Objektiv
Neben der Untersuchung der Kinetik der MRE11-Rekrutierung an Strangbruchstellen untersuchten wir auch die Reaktionen von γH2AX, einem Histon-Protein, das an DNA-Doppelstrangbrüchen phosphoryliert wird und DDR-Mechanismen aktiviert, sowie von CHD4, einem Protein, das bei der epigenetischen Transkriptionsregulation eine wichtige Rolle spielt. Genaue Kolokalisationsstudien erfordern eine Minimierung der chromatischen Aberration, da diese zu einer signifikanten lateralen Verschiebung der verschiedenen Aufnahmekanäle führen kann. Um die Auswirkungen der chromatischen Aberration bei unseren Kolokalisationsstudien zu minimieren, verwendeten wir das superkorrigierte chromatische Aberrationsobjektiv PLAPON60XOSC2 von Olympus, das zuverlässige Kolokalisationsbilder mit extrem geringer lateraler und axialer chromatischer Aberration liefert. Dadurch konnten wir feststellen, dass CHD4 und γH2AX an Stellen mit DNA-Schädigung im Zellkern kolokalisiert waren.
Abb. 3: Rekrutierung von endogenen DNA Damage Repair-Proteinen zu DNA-Strangbrüchen
Nachweis von endogenem CHD4 (grün, Alexa Fluor 488) und γH2AX (rot, Alexa Fluor 594) in U2OS-Epithelkrebszellen menschlicher Osteosarkome nach laserinduzierter DNA-Schädigung. Das zusammengeführte Bild zeigt die Kolokalisierung von CDH4 und γH2AX.
Vorteile des konfokalen Mikroskops FV3000 für unseren Versuch
Hohe Empfindlichkeit für die Bildgebung von lebenden Zellen durch Vollspektrum-System mit hocheffizienten GaAsP-Detektoren
In der Serie FV3000 kommt die TruSpectral-Detektionstechnologie von Olympus zur Anwendung, bei der das Licht durch Transmission durch eine Volumen-Phasen-Hologramm-Einheit gebeugt wird. Diese Technologie ermöglicht einen wesentlich höheren Lichtdurchsatz als herkömmliche spektrale Detektionseinheiten mit Reflexionsgittern. Der hochempfindliche Zweikanal-Spektraldetektor (HSD) des Mikroskops FV3000 erreicht durch die TruSpectral-Technologie mit Peltier-gekühlten GaAsP-PMTs eine hohe Quanteneffizienz von 45 % bei einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Diese Kombination der Detektionstechnologien ermöglicht eine leistungsstarke, hochempfindliche Erkennung und eine Minimierung der für die Betrachtung von lebendem Gewebe erforderliche Laserstärke.
Zuverlässige Kolokalisationsanalyse mit geringer chromatischer Aberration durch das superkorrigierte Objektiv PLAPON60XOSC2
Dieses Ölimmersionsobjektiv minimiert die laterale und axiale chromatische Aberration im Spektrum von 405–650 nm. Kolokalisationsbilder werden zuverlässig erfasst, und die Bilder werden mit hervorragender Positionsgenauigkeit vermessen. Das Objektiv kompensiert auch chromatische Aberrationen im nahen Infrarot bis zu 850 nm und ist damit für die quantitative Bildgebung bestens geeignet.
Objektiv mit geringer chromatischer Aberration
Vergrößerung: 60x
NA: 1,4 (Ölimmersion)
WD: 0,12 mm
Kompensationsbereich der chromatischen Aberration: 405–650 nm
Den Fokus bewahren mit dem TruFocus-System von Olympus
Das TruFocus-Modul verwendet minimal fototoxisches Infrarotlicht (Laserklasse 1), um die Probenebene zu identifizieren. Mit dem One-Shot-Autofokus-Modus (AF) lassen sich mehrere Fokuspositionen für tiefere Proben einstellen, wodurch sich die Effizienz der Z-Stapel-Erfassung bei Versuchen mit mehreren Positionen erhöht.
Kommentar von Dr. Kyle Miller
Dr. Kyle Miller |
Dr. JaeJin Kim | Fluoreszenz-Bildgebung ist eine weit verbreitete Technik zur Analyse der Lokalisierung und Kinetik von Response-Faktoren an DNA-Bruchstellen in Studien der Signalisierung und Reparatur von DNA-Schäden. Diese Informationen waren wesentlich dafür, auf Einzelzellebene herauszufinden, wie diese Faktoren DNA-Läsionen erkennen und reparieren. Mit dem Mikroskop FV3000 konnten Dr. JaeJin Kim und Mitarbeiter im Miller-Labor DNA-Schäden durch Laser-Mikrobestrahlung erzeugen und den Mechanismus von Response-Faktoren sowohl in fixierten als auch in lebenden Zellen untersuchen. Durch seine empfindlichen Detektoren, die automatische Fokussierung und superkorrigierte Objektive eignet sich das Mikroskop FV3000 zur effektiven Durchführung von Studien zu Response-Mechanismen bei DNA-Schäden in menschlichen Krebszellen. |
Danksagungen
Dieser Anwendungshinweis wurde durch Mitwirkung folgender Forscher erstellt:
Die Universität von Texas in Austin, NMS, Dr. Kyle Miller und Dr. JaeJin Kim
Verwendete Produkte
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