Fluoreszenzbildanalyse – Assay auf lebende und tote Zellen in Sphäroiden

Der Anteil von toten Zellen in Sphäroiden und die Wirksamkeit von Arzneimitteln können mithilfe eines konfokalen Mikroskops und des Zellzählungsmoduls der NoviSight Software quantitativ bestimmt werden.

Ziele

Zwischen der Oberfläche eines Tumors und seinem Kern besteht ein Diffusionsgradient für Sauerstoff und Nährstoffe. Diese schwierige Umgebung führt dazu, dass Zellen tief im Inneren des Tumors in den Ruhezustand übergehen oder absterben. Es wird angenommen, dass Sphäroide die Mikroumgebung von Tumoren nachbilden. Bisher mussten zur Untersuchung des Inneren von 3D-Proben einzelne Schnitte separat hergestellt werden. Die Entwicklung von Methoden der Gewebeklärung macht es inzwischen jedoch möglich, das Innere von 3D-Proben zu beobachten und dabei deren strukturelle Integrität zu erhalten. In dieser Studie wurden konfokale Bilder von mit Fluoreszenzfarbstoffen gefärbten, fixierten und transparent gemachten Krebs-Sphäroiden einer quantitativen 3D-Analyse mit der NoviSight Software unterzogen. Die Studie zeigt, dass sich mithilfe eines Klärungsreagenz und der NoviSight Software arzneimittelunabhängiger und -abhängiger Zelltod bestätigen lassen.

Vorbereitung der Proben

Eine Suspension aus HT-29-Zellen wurde in einer Dichte von 500 Zellen/Well in PrimeSurface 96U Platten (SUMITOMO BAKELITE CO., LTD, Japan), d. h. Platten mit U-Boden, gegeben. Acht Tage nach Beginn der Zellkultur wurden Staurosporin (STS) in verschiedenen Konzentrationen und NucView550 in die Wells gegeben. Nach Inkubation über 1 Tag wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,5 % TritonX-100/PBS permeabilisiert. Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei 4 °C mit Hoechst 33342 gefärbt und die Sphäroide mit ScaleS transparent gemacht.

Schlussfolgerung
Aufnahme und Analyse von Fluoreszenzbildern

Mit dem konfokalen Laser-Fluoreszenzmikroskop FV3000 wurden konfokale Fluoreszenzbilder der oben beschriebenen Sphäroide aufgenommen. Selbst bei Fehlen von STS wurden Zellkerne tief im Inneren der Sphäroide mit NucView550 (A) angefärbt, was darauf hinweist, dass eine Apoptose stattfindet. Die Zellkernerkennung und die Zellzählungsanalyse mit der NoviSight Software ermöglichen die Quantifizierung des Anteils toter Zellen (B), und es ließ sich bestätigen, dass die Induktion des Zelltods durch STS dosisabhängig erfolgte (C,D). Diese Ergebnisse zeigen, dass die NoviSight Software zur quantitativen Beurteilung des arzneimittelinduzierten Zelltods in 3D-Strukturen beitragen kann.

PrimeSurface ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan.
Olympus ist ein eingetragenes Warenzeichen. NoviSight und Insightful Analysis, Intelligent Answers sind Warenzeichen der Olympus Corporation.